斑马鱼胚胎评价5种药物的发育毒性与模型验证

目的用斑马鱼胚胎探究环磷酰胺、乙酰水杨酸、盐酸四环素、乙酸地塞米松、阿扎胞苷5种已知对人类胚胎致畸药物的毒性和安全性。方法挑选4 hpf发育正常的受精卵,采用水浴染毒法,将药物添加到人工海水中,每种药物分别设置5个浓度组,另设空白对照组和溶剂对照组,观察给药120 hpf后斑马鱼的死亡情况,统计各实验组斑马鱼胚胎的死亡数、畸形数,并求出120 hpf时斑马鱼胚胎的死亡率、畸形率、半数致死浓度(LC50)、半数致畸浓度(EC50)、致畸指数(TI)。并利用公式:TI=LC50/EC50计算出阳性药物的致畸指数。根据已经测得的LC50,求出各药物的最大非致死浓度(MNLC),分别设置1/10 MNLC、1/3 MNLC,MNLC和LC104个浓度,以沙利度胺为阳性对照,维生素C为阴性对照,人工海水为空白对照,0.5%DMSO为溶剂对照,28.5℃下作用至120 h,每天观察胚胎的发育情况,统计胚胎死亡及畸形状态。结果 5种药物的LC50从大到小依次为:环磷酰胺>阿扎胞苷>盐酸四环素>乙酰水杨酸>乙酸地塞米松。EC50从大到小依次为:环磷酰胺>盐酸四环素>阿扎胞苷>乙酰水杨酸>乙酸地塞米松。环磷酰胺、乙酰水杨酸、盐酸四环素、乙酸地塞米松、阿扎胞苷TI值分别为1.92,1.11,1.05,1.44,2.99。结论斑马鱼胚胎模型可用于初步评价药物的发育毒性和安全性。

几种植物原花青素及其片段化产物的抗ROS活性评价

利用野生型AB系斑马鱼建立的整体斑马鱼ROS检测模型,对提取于马尾松树皮、云南松树皮、木荷树皮、桂皮、莲房、澳洲坚果内壳和油茶籽粕的原花青素及其片段化产物进行了体内抗ROS活性功能评价。结果表明,这几种原花青素通过基于茶多酚的片段化反应后,其产物的抗ROS活性功能均有不同程度的提高,其中桂皮和油茶籽粕的原花青素片段化产物的抗氧化活性得到显著提高。

基于斑马鱼模型进行马兜铃酸心血管毒性的评价

目的:利用斑马鱼模型对马兜铃酸进行心血管毒性的评价。方法:设置4个不同浓度的马兜铃酸溶液,同时设置空白对照组(养鱼水处理组)和溶剂对照组(0.1%DMSO)处理一定阶段的野生型AB系斑马鱼幼鱼至实验终点,每个浓度处理30尾斑马鱼。待测药物处理斑马鱼4 h后,随机选择10尾斑马鱼对心率进行计数。待测药物处理至实验终点时,在立体解剖显微镜下观察有无心包水肿、血流速度变化、血栓及出血等,计算各表型发生率。另设置4个不同浓度的马兜铃酸溶液,并分别设置空白对照组(养鱼水处理组)和溶剂对照组(0.9%Na Cl注射液)处理组,至实验终点每个浓度收集100尾斑马鱼(-80℃贮存),提取mRNA反转成c DNA样本后,进行荧光定量RT-PCR检测斑马鱼组织中MicroRNA146a的表达。结果:当马兜铃酸浓度≥MNLC/3时,可诱发斑马鱼心血管毒性,并呈现浓度相关性增加,表现为血流变慢或(和)缺失、静脉窦处瘀血、静脉窦处水肿和心率变慢(仅LC10处理组),未见心律不齐。荧光定量RT-PCR结果显示,马兜铃酸的4个浓度MNLC10、MNLC/3、MNLC、LC10均显著提高MicroRNA146a的表达(与对照组比较P<0.01),且存在一定的浓度关系。结论:马兜铃酸具有一定的心血管毒性作用,且具有浓度相关性。

斑马鱼高血脂模型在山青之片质量控制中的应用研究

目的:探讨斑马鱼高血脂模型在山青之片质量控制中的应用。方法:用高脂肪饮食诱导的斑马鱼高血脂模型对山青之片进行生物活性评价和质量稳定性检测。结果:斑马鱼高血脂模型作为降血脂药物生物学质量内控检测方法具有较好的可重复性(RSD为3.5%)及稳定性(RSD为3.6%);不同批号山青之片具有较好的质量稳定性,其血脂降低率平均值为60.8%(P<0.001),RSD为1.9%;同批次山青之片供试品溶液室温放置8 h以内质量稳定,血脂降低率平均值为60.5%(P<0.001),RSD为3.1%。结论:用斑马鱼高血脂模型评价中药山青之片的降血脂效果,方法快速、稳定可靠;应用斑马鱼模型建立中药的生物学质量标准有助于推动中药的现代化,值得尝试和推广。

呋喃二烯抗癌药效学评价及作用机制研究

目的使用斑马鱼模型体内评价呋喃二烯对乳腺癌和胰腺癌的抗肿瘤效果,研究呋喃二烯的可能抗癌机制.方法通过将人类乳腺癌细胞和胰腺癌细胞移植到斑马鱼体内建立斑马鱼肿瘤移植模型,评价呋喃二烯抗癌药效;呋喃二烯直接处理正常斑马鱼,观察对斑马鱼的凋亡作用和抑制血管作用,结果呋喃二烯（1.4、4.1和12.2μmol·L^-1对乳腺癌移植瘤和胰腺癌移植瘤的生长均有明显抑制作用.呋喃二烯（4.1、13.5和40.5μmol·L^-1）能显著诱发斑马鱼细胞凋亡.100μmol·L^-1呋喃二烯能明显抑制斑马鱼血管形成.结论：呋喃二烯抗乳腺癌和胰腺癌效果明显,抗癌机制可能为诱发细胞凋亡和抑制肿瘤血管形成.

苯肼诱发建立斑马鱼血栓模型的方法

目的建立操作便捷、快速、稳定的活体斑马鱼血栓模型。方法研究不同浓度苯肼诱导下斑马鱼血栓形成情况。以2dpf（days post fertilization，dpf,受精后天数）健康AB系野生型斑马鱼作为实验动物，将其暴露于不同浓度（0．5BmoL／L、1gmoL／L、2μmoL／L、4μmoL／L、8μmoL／L）的苯肼中，同时设置空白对照组（胚胎养殖用水）和溶剂对照组（0．1％乙醇），处理一段时间后，通过观察斑马鱼尾静脉血流及血栓形成情况进行定性分析，利用邻联茴香胺染色法对心脏红细胞染色强度进行定量分析。结果苯肼处理组（模型组）有血栓形成，与溶剂对照组相比有显著性差异（P〈0．001）。血栓形成率先增高后逐渐减缓，0．5μmoL／L、1μmoL／L血栓形成较少，血栓形成率分别为（19．79±1．55）％、（43．28士1．82）％、2μmoL／L、4μmoL／L、8μmoL／L均诱发较为严重的血栓，血栓形成率分别为（69．85±1．12）％、（70．56±4．60）％和（72．25±2．11）％，三组间没有差异。结论苯肼浓度2μmoL/L为诱发稳定的活体斑马鱼血栓模型的最佳浓度。

斑马鱼在中药深度开发中的应用

目的中药是中国国粹的重要组成部分,有悠久的临床使用经验,在复杂疾病治疗及保健和疾病预防方面具有独特优势.但中药也存在一些问题,如成分复杂、作用机制不明、毒性不清、标准不统一等问题阻碍了中药现代化的进程.斑马鱼模型既具有体外实验快速、高效、低廉、用药量小等优势,又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高、可观察多个器官等优点,可以很好地补充和完善现有的药物生物学筛选体系和方法,非常适合用于进行中药的研究开发.目前,斑马鱼模式生物在中药药效学及安全性评价中有着广泛应用,在中药质量控制方面的研究正在深入开展,在中药道地药材鉴别、炮制与工艺的优化以及中医疾病模型的建立中亦有一定的建树.相信随着斑马鱼药物研发技术将在中药研究开发中发挥积极的推动作用.

锗水增强免疫力作用研究

目的:评价锗水增强免疫力作用;方法:随机选取120尾受精后2天(2dpf)转基因中性粒细胞与巨噬细胞绿色荧光斑马鱼于六孔板中,每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼,静脉窦注射给予红色荧光微球建立斑马鱼促吞噬模型。模型斑马鱼水溶给予4倍浓缩锗水和阳性对照药百令胶囊15μg/mL浓度,同时设置正常对照组,每孔容量为3mL。锗水处理结束后,每组随机取10尾斑马鱼在荧光显微镜下采集图片,用图像处理软件计算巨噬细胞荧光强度及巨噬细胞吞噬清除后荧光微球残留个数;结果:根据巨噬细胞荧光强度的统计学意义评价锗水对斑马鱼巨噬细胞生成的促进作用,根据荧光微球残留个数的统计学意义评价锗水对斑马鱼巨噬细胞吞噬的促进作用。

基于代谢组学和抗肿瘤活性的2种源自不同中华大蟾蜍亚种蟾酥的系统比较研究

比较中华大蟾蜍指名亚种Bufo gargarizans gargarizans和中华大蟾蜍华西亚种B.gararizans andrewsi所产蟾酥差异,基于斑马鱼模型验证蟾酥市场价值导向的合理性。收集来自江苏、河北、辽宁、吉林、四川凉山等地包括指名亚种蟾酥和华西亚种蟾酥共20批,通过UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS液质联用技术结合主成分分析等比较指名亚种和华西亚种的蟾酥差异。根据VIP>1、FC<0.5或FC>2.0、峰面积占比>1%的限制条件确定了9个质量标志物,分别为华蟾酥毒基、华蟾毒它灵、沙蟾毒精、脂蟾毒配基、海葱苷元A、惹斯蟾蜍精、沙蟾毒精-3-辛二酰精氨酸酯、南美蟾毒精-3-辛二酰精氨酸酯、脂蟾毒配基-3-辛二酰精氨酸酯;并按《中国药典》采用高效液相色谱法对20批蟾酥进行含量测定,选择蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基3个药典质量控制指标总量差异最大的2批蟾酥(CS7,总量为8.99%;CS9,总量为5.03%)分别进行基于斑马鱼模型的抗肝肿瘤活性评价,二者抑瘤率分别为38.06%、45.29%。证明仅以药典质量控制指标高低作为蟾酥市场流通的价值导向是不合理的。该研究为蟾酥资源的有效利用,蟾酥质量评价体系的合理建立提供了数据支撑。

斑马鱼神经元损伤模型在养血清脑颗粒质量控制中的应用分析

目的：探讨斑马鱼神经元损伤模型在养血清脑颗粒质量控制应用的可行性,为该制剂提供一种新型生物活性质量控制方法。方法：以养血清脑颗粒为例,采用吗替麦考酚酯诱导的斑马鱼神经元损伤药效模型对养血清脑颗粒进行神经细胞保护生物活性评价和质量稳定性检测。结果：斑马鱼神经元损伤模型作为神经细胞保护药物生物活性质控方法具有较好的精密度,日内RSD 2.2%～3.7%,日间RSD 1.2%;重复性（RSD 8.4%）和稳定性（RSD 4.9%）良好;在0.10～1.00 g·L-1内养血清脑颗粒对神经细胞保护率成良好的线性关系,方法学考察符合生物活性测定指导原则的要求。结论：采用斑马鱼神经元损伤模型评价养血清脑颗粒神经细胞保护作用的方法快速、稳定可靠,可作为现有质量控制方法的有效补充,为中药的生物活性质量控制研究提供一定的技术参考。

脑脉泰胶囊对外周神经元损伤模型斑马鱼神经再生的影响

目的探讨脑脉泰胶囊治疗脑梗死的可能作用机制。方法脑脉泰胶囊用超纯水溶解成50、100、250、500、1000、1500μg/ml 6个浓度,均分别处理30尾野生型AB系斑马鱼24h后,统计各组斑马鱼死亡数量,绘制浓度效应曲线,并计算最大非致死浓度,筛选实验药物浓度。取受精后1天运动神经元转基因荧光斑马鱼,分为空白对照组、模型组、阳性对照组和脑脉泰胶囊高、中、低剂量组,每组30尾。除空白对照组外,其余各组斑马鱼用1.5%乙醇诱导处理斑马鱼48h建立斑马鱼外周运动神经元损伤模型。造模结束后,阳性对照组给予L-甲状腺素钠0.08μmol/L,空白对照组和模型组给予养鱼用水,脑脉泰胶囊低、中、高剂量组分别给予筛选浓度的脑脉泰胶囊处理24h。药物处理结束后,利用图像处理软件测量外周运动神经元的长度,计算促神经再生率。结果脑脉泰胶囊浓度在50、100μg/ml时,斑马鱼无死亡;浓度为250μg/ml时斑马鱼开始出现死亡,根据浓度效应曲线得出脑脉泰胶囊最大非致死浓度为170μg/ml,故本研究选取17、57、170μg/ml为脑脉泰胶囊低、中、高剂量组干预浓度。与空白对照组比较,模型组斑马鱼外周运动神经元长度显著缩短(P<0.01);与模型组比较,阳性对照组和脑脉泰胶囊低、中、高剂量组斑马鱼外周运动神经元长度增加(P<0.01);与阳性对照组比较,脑脉泰胶囊中、高剂量组斑马鱼外周运动神经元长度差异无统计学意义(P>0.05),而脑脉泰胶囊低剂量组斑马鱼外周运动神经元长度降低(P<0.01)。阳性对照组和脑脉泰胶囊低、中、高组促神经再生率分别为31%、17%、29%、30%。结论脑脉泰胶囊对外周神经元具有促神经再生作用,可能为其治疗脑梗死作用机制之一。

斑马鱼模型在药物毒性与安全性评价中的应用

目前国际上公认的药物毒性与安全性评估实验方法分为体外与体内实验2种。体外实验具有快速、高效和经济等优点,但体外实验通常不涉及药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄,因此筛选结果与整体动物试验结果可比性差。

三种斑马鱼血瘀模型在三七抗血栓及抗心肌缺氧能力评价中的应用

目的:采用不同诱导剂建立3种斑马鱼血瘀模型,优选最适宜评价三七活血能力的模型。方法:花生四烯酸(AA),普纳替尼(Ponatinib),异丙肾上腺素(ISO)分别建立斑马鱼血瘀模型,设置正常组、模型组、阳性药组、不同浓度三七水提物冻干粉组,计算心脏红细胞染色强度、心脏凋亡细胞荧光强度,评价三七的抗血栓作用和抗心肌缺氧能力。基于优选的评价三七活血化瘀活性的血瘀模型—AA,ISO诱导的斑马鱼血瘀模型,比对三七水提取物及70%甲醇提取物之间的活性,并采用UHPLC LTQ-Orbitrap MS/MS技术比对其化学成分差异。结果:AA,Ponatinib诱导后斑马鱼心脏红细胞染色强度显著降低(P<0.01),ISO诱导后心脏凋亡细胞荧光强度显著升高(P<0.01),三七水提物冻干粉可以拮抗AA模型的血栓形成(P<0.01)和ISO模型的心肌凋亡(P<0.05),对Ponatinib模型血栓形成无显著改善作用。三七70%甲醇提取物冻干粉可以抑制ISO血瘀模型的心肌凋亡(P<0.01),作用强于三七水提物冻干粉,其成分差别主要在于人参皂苷Re等部分皂苷类以及氨基酸类、炔醇等成分。结论:AA,Ponatinib,ISO均可建立斑马鱼血瘀模型,其中AA和ISO模型可以用于评价三七水提物冻干粉的活血能力。水提和70%甲醇提取三七冻干粉化学成分差异较大,对ISO血瘀模型,70%甲醇提取三七冻干粉抗心肌缺氧能力更强,皂苷、炔醇类成分可能与其活血化瘀功效密切相关。

睡安片对咖啡因诱导斑马鱼失眠症的改善作用

目的观察睡安片对咖啡因诱导失眠症斑马鱼的镇静作用和睡眠改善作用,评价睡安片对失眠症的疗效。方法采用200μmol/L咖啡因诱导活体斑马鱼建立失眠症模型,并确定睡安片的最大非致死浓度(MNLC)。睡安片选取MNLC(1 200μg/m L)、1/3 MNLC(400μg/m L)、1/10 MNLC(120μg/m L)3个质量浓度,同时设置对照组、模型组和氯化锂(500μg/m L)组,每组均处理30尾斑马鱼幼鱼,使用行为分析仪测量斑马鱼的运动距离和处于失眠状态的时间,计算镇静作用和睡眠改善作用。结果睡安片的MNLC为1 200μg/m L。120、400、1 200μg/m L睡安片组与模型组比较,运动距离均显著减少,差异具有极显著性(P<0.001),镇静作用分别增加0.69、1.66、2.74倍。除120μg/m L质量浓度外,400、1 200μg/m L组与模型组比较,失眠时间显著减少,差异具有极显著性(P<0.001),睡眠改善作用分别增加1.63、2.65倍。结论睡安片对咖啡因诱导失眠症斑马鱼具有明显的镇静和睡眠改善作用,呈现明显的浓度相关性。