液相色谱-串联质谱法检测干血点样本中25-羟基维生素D_2和25-羟基维生素D_3

建立了一种高通量液相色谱-串联质谱技术检测干血点(DBS)样本中25-羟基维生素D_2[25(OH)D_2]和25-羟基维生素D_3[25(OH)D_3]的方法。以DBS为样本,以4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)为试剂进行分析物衍生化,所需样本量仅约相当于6μL全血当量的DBS样本;使用甲醇直接超声提取分析物,避开了通常情况下DBS样本前处理中的全血复溶和蛋白质沉淀等繁琐步骤;整个前处理过程使用自动化液体处理平台实现自动化操作和高检测通量;以25(OH)D_2-D6和25(OH)D_3-D_3为同位素内标,消除基质效应的影响。前处理后的样本进行LC-MS/MS分析,使用C_(18)柱进行分离,流动相为甲醇(含5 mmol/L甲酸铵)-水(含5 mmol/L甲酸铵)(75∶25,V/V),洗脱时间为4 min,使用多反应监测模式(MRM)定量。结果表明:25(OH)D_2和25(OH)D_3的检出限为0.12 ng/m L(S/N=3),定量限为0.94 ng/m L(S/N=10)。25(OH)D_2和25(OH)D_3在0.94~120.00 ng/m L范围内线性关系良好,日内相对标准偏差(RSD)分别为1.4%~8.6%和3.7%~15.5%,日间RSD分别为4.0%~5.3%和3.8%~14.9%,平均回收率分别为91.7%±7.9%~108.5%±6.5%和94.8%±6.8%~101.3%±2.9%。DBS样本在不同温度(-20℃,22℃,37℃)下储存不同时间(0,1,2,3,5,7,14天)后的稳定性实验显示样本总体RSD<15%。以25(OH)D参考物质NIST SRM 972a中的Level 3制备标准DBS样本,25(OH)D_2和25(OH)D_3的回收率分别为110.3%和103.0%。

液相色谱-串联质谱法检测干血点中的同型半胱氨酸

建立了一种高通量液相色谱-串联质谱技术检测干血点(DBS)中同型半胱氨酸(homocycteine,Hcy)的方法。以DBS为样本,homocystine-D8为同位素内标,二硫苏糖醇(DTT)为蛋白结合态Hcy的还原剂,使用含0.1%(v/v)甲酸、0.05%(v/v)三氟乙酸的乙腈溶液萃取。整个前处理过程使用自动移液平台及96孔板实现高通量自动化操作。处理后的样本经过Phenomenex CN柱分离,使用多反应监测模式进行LC-MS/MS分析。结果表明:Hcy的检出限为0.12μmol/L(S/N=3),定量限为0.46μmol/L(S/N=10)。Hcy在1.16~148.00μmol/L范围内线性关系良好,R^2=0.994。Hcy的平均回收率为(103.0±4.97)%^(112.0±2.13)%,日内相对标准偏差(RSD)为1.9%~4.6%,日间RSD为1.5%~7.1%。DBS样本在不同温度(-4、-20、22和37℃)下储存不同时间(0、1、2、3、4、5、6、14天)后的稳定性试验显示样本总体RSD<15%,经前处理后的样本在48 h内的稳定性试验显示样本总体RSD<5%。该方法与传统生化分析方法的相关性好(R^2=0.9818,n=47)。

液相色谱-串联质谱法快速检测干血点样品中尿酸

建立了一种高通量液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测干血点(DBS)样品中尿酸(UA)的方法。采用自动液体操作平台对样品进行高通量自动化前处理,首先用含有UA-1,3-15 N2稳定同位素内标的Tris水溶液进行萃取,然后用含有0.1%甲酸、0.05%三氟乙酸的乙腈溶液沉淀蛋白质。处理后的样品经CN色谱柱分离,多反应监测(MRM)模式进行LC-MS/MS分析。结果表明,在DBS样品中,UA在7.8~1 000μmol/L浓度范围内的线性关系良好(R2=0.999);检出限为3.1μmol/L(S/N=3);定量限为12.5μmol/L(S/N=10);平均回收率为95%~101%;日内相对标准偏差(RSD)为4.2%~12%;日间RSD为5.3%~14%。以样品中UA检测结果的总体RSD不超过15%来考察样品稳定性,分别将样品在-20℃保持30天、在37℃保持7天、反复冻融5次,样品中UA检测结果总体RSD小于10%,表明样品稳定性良好。将该方法与传统生化分析方法相比较,并分析了204份血样,相关性较好(R2=0.946)。此方法可为有限采血条件下UA的检测及UA相关疾病的大规模筛查提供新途径。