三种侧耳漆酶在烷基咪唑类离子液体中催化特性的研究

漆酶在纸浆漂白、纤维改性、废纸脱墨、废水氯代酚降解等方面有广阔的应用前景,使用离子液体/水混合溶剂可以提高漆酶催化不溶性底物合成或降解的效率,但同时会造成酶的活力下降。作者从红平菇、榆黄菇和糙皮侧耳菌糠中分离得到漆酶并研究了它们在烷基咪唑类离子液体中的催化特性。结果表明,红平菇、榆黄菇和糙皮侧耳漆酶在三种离子液体中均受到抑制作用。几种溶剂的抑制作用排序如下:乙醇<丙酮<1-乙基-3-甲基咪唑硫酸乙酯盐([EMIM]EtOSO_3)<1-丁基-3-甲基咪唑磷酸二丁酯([BMIM]DBP)<1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐([EMIM]Ac)。动力学分析表示,离子液体[EMIM]EtOSO_3与底物2,2'-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)对酶分子活性位点发生了竞争性结合,因此推测,漆酶在离子液体中的表观活力与初始酶用量无关,增加ABTS浓度有利于提高反应速率和酶的利用效率。

高温碱性条件下漆酶活力测试方法的研究

用带控温装置的紫外可见光谱仪作为高温酶活检测平台,建立了以2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物的高温、碱性漆酶活力测试方法,着重探讨了ABTS游离基(ABTS·+)消减对测试的影响,结果表明,本测试系统可供进行83℃以下动力学光谱分析,可用于漆酶的耐温、耐碱性研究,宜采用低离子浓度(4 mmol/L)缓冲液做介质,测试时长1 min,按此条件,在pH 4、7和10时,因ABTS·+消减而产生的误差绝对值分别低于1%,1.5%和5%。使用该系统测得诺维信漆酶最适pH为4.5、最适温度为60℃,还从三种担子菌漆酶中筛选出具有较高耐温性的乌芝酶。

福氏志贺菌来源L-鼠李树胶糖激酶的克隆表达及酶学性质分析

D-阿洛酮糖是一种具有保健功能的稀有糖,目前其生产主要利用D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPE)将D-果糖转化为D-阿洛酮糖,但该反应转化率低,仅能达到30%左右。基于L-鼠李树胶糖激酶(L-rhamnulose kinase,RhaB)的“磷酸化-脱磷酸”级联反应可提高反应转化率,然而目前有关RhaB的研究较少。该文研究了一种新型来源福氏志贺菌(Shigella flexneri 2a str.301)来源的RhaB,从福氏志贺菌(S.flexneri 2a str.301)的基因组DNA中克隆得到RhaB基因,将其与质粒载体pET28a连接,在Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达。构建突变菌株RhaB^(E437Q),将酶活性提高了10倍,且大部分包涵体蛋白变为可溶性蛋白。利用载体上组氨酸标签对重组酶分离纯化,对其酶学性质进行了一系列研究。结果表明,重组蛋白RhaB^(E437Q)为单体蛋白,分子质量为54 kDa;最适反应条件为40℃,pH 8.5,Mn^(2+);其只对C-3构型为R构型的糖有催化活性;将其与底物D-阿洛酮糖进行分子对接,对其催化机制进行了初步研究。

基于组合优化策略在毕赤酵母中高效表达杜邦嗜热菌脂肪酶

杜邦嗜热菌脂肪酶(LIP1)是一种在洗涤行业、生物柴油制备、油脂改性等领域具有良好应用潜力的碱性脂肪酶,然而其天然产量极低,难以满足产业化需求。采用组合优化策略筛选出高效表达LIP1的毕赤酵母重组菌株。首先,构建毕赤酵母密码子偏好性优化的LIP1基因,通过高浓度G418抗性平板和BMMY-罗丹明B定性平板筛选出脂肪酶活性较高的重组菌株;其次,利用信号肽优化和分子伴侣共表达优化筛选得到一株高效表达的重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1,采用碱滴定法测定其酶活,采用比色法测定其底物特异性。结果表明,经组合优化策略筛选出的菌株在摇瓶和5 L发酵罐中发酵最高分泌酶活分别达到1 136 U/mL和12 150 U/mL。底物特异性结果显示重组脂肪酶LIP1最适底物为C8链长的对硝基苯酚酯。综上所述,基于组合优化策略实现了LIP1在毕赤酵母中的高效表达,为未来LIP1的产业化奠定基础。

Areca traindra过氧化物酶的分离及其应用于合成木质素模型物的研究

从棕榈科植物三药槟榔(Areca triandra)的果实中分离了过氧化物酶(AtrP)用于催化异丁香酚合成脱氢聚合物。实验结果表明,Atr P粗酶液经过盐析和丙酮沉淀得到了部分纯化,酶活回收率70.2%,比活力达到2216 IU/mg(25℃测定)。该酶适宜的温度范围是25～40℃,最适p H_6,受MnSO_4、FeCl_2、Mg SO_4、乙醇、丙酮和1,4-二氧六环的抑制。AtrP/H_2O_2氧化异丁香酚单体得到不溶于水的油状物,红外光谱显示侧链丙烯基发生氧化,可能生成醛基、酮基、羧基等新的官能团,芳环则参与单体的聚合,甲氧基脱除不显著。气质联用(GC-MS)和液质联用(LC-MS)分析表明,AtrP/H_2O_2氧化异丁香酚的产物含有二聚体(50.3%)、香草醛(40.2%)和4-羟基-3-甲氧基苯丙酮等杂质(8.1%),Atr P作为一种新的氧化还原酶,在人工合成脱氢聚合物以及生产木质素基化学品方面具有一定的应用前景。

ERP管理软件在会计工作中存在的问题与思考

财务软件“用友”在会计工作中扮演着极其重要的角色，绝大多数企业采用该软件对自身企业进行会计核算，但相对于企业的整体管理，ERP管理软件却更胜一筹，其有着独特的优势，且在处理会计业务上具体优越性。相比于专业财务软件，ERP管理软件在会计工作中存在着许多问题，比如会计数据的真实性、财务滞后以及完整性未能达到预期效果等。本文通过分析ERP管理软件在会计工作中存在的问题，并思考如何解决这些问题，提出行之有效的措施。

枯草芽孢杆菌来源的碱性果胶酶在毕赤酵母中的高效表达

以Bacillus subtilis 168来源的碱性果胶酶(PELA)为研究对象,首先采用毕赤酵母密码子偏好性优化,结合G418高浓度抗性筛选策略,构建了PELA突变体工程菌株Pp03;其次,通过信号肽(MF4I、HFBI、W1、Albumin、Invertase 2)优化和分子伴侣(BMH2、HAC1、PDI1、KEX2)共表达,获得一株高效表达PELA的工程菌株Pp13;接着对该菌株摇瓶表达PELA的诱导温度、甲醇添加量进行优化;最后,采用5 L发酵罐进行高密度发酵。结果显示,PELA的基因经过密码子、信号肽以及伴侣因子优化后,实现PELA的酶活分别提高至2.10、7.35、1.49倍,其酶活分别达到39.11、353.87、527.27 U/mL;最佳诱导温度和甲醇添加量分别为26 ℃和1.0%;在最佳诱导条件下,PELA的摇瓶水平酶活达到732.60 U/mL;采用5 L发酵罐进行高密度发酵,PELA的酶活达到2301.05 U/mL。研究结果为碱性果胶酶的工业化应用提供理论依据,同时也为毕赤酵母中异源蛋白的高效表达提供方法参考。

细菌素对产生菌获得生存优势及其诱导合成条件的研究进展

细菌素可以有效抑制其他细菌的生长,是产生菌获得生存优势的重要手段。细菌素使产生菌获得竞争优势基于两个方面:就产生菌自身而言,将细菌素吸附于细胞表面可能增强细胞表面疏水性,进而对定殖产生正向作用;就目标菌而言,细菌素可以自外而内抑制目标菌生物被膜、细胞壁、细胞膜的合成或破坏其结构完整性,同时还可影响其功能基因的表达。然而,伴随细菌素合成的往往是一簇基因的共同表达,需要一定的非生长相关性能量和物质消耗。因此,为实现细菌素合成的调控,细菌素表达基因的开启受制于细菌素自诱导、共培养诱导和环境因子诱导等一系列条件,以实现细菌素利用效率的最大化。根据细菌素主要的抑菌/杀菌机制,我们展望了细菌素耐受性突变菌株可能具有更强流动性细胞膜和(或)更高效小分子合成途径和(或)细菌素受体突变的特征,并提出了科学使用细菌素的建议。

耐高温α-淀粉酶分子结构与异源表达研究进展

耐高温α-淀粉酶是数千年前即取得工业化应用的重要工业用酶。由于其具有热稳定性好、液化彻底、易保存等优势,在淀粉制糖、味精、啤酒等食品发酵以及纺织印染等行业都有着广泛的应用。本文首先就耐高温α-淀粉酶的菌种来源、结构与功能、α-淀粉酶酶活性提升、基因工程菌的构建等方面已取得的研究成果进行综述,然后对耐高温α-淀粉酶外源表达最新研究成果进行了总结。文章最后分析讨论了在耐高温α-淀粉酶开发方面国内现有水平与国际领先水平的差距,以期为耐高温α-淀粉酶的开发提供参考及思路。相信随着代谢工程和过量表达等技术手段的相继应用及业界的持续努力,我国耐高温α-淀粉酶的开发必将取得飞跃式发展。

基于壳聚糖结合模块构建新型酿酒酵母孢子表面展示系统

【目的】基于当前细胞表面展示体系存在的问题,旨在构建一个新型的普适性强、抗逆性好、高效稳定的酿酒酵母孢子表面展示系统。【方法】首先,根据酵母孢子固定化酶的特性,通过查阅文献寻找潜在的与孢子壁壳聚糖层高度亲和的壳聚糖结合模块;其次,利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)与结合模块融合表达,在体外和孢子内分别验证结合模块与孢子壁的亲和能力;之后,选择Saccharomyces cerevisiae AH109来源的α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,MEL1)评估新型展示体系的效能。【结果】首先,选择Paenibacillus sp.IK-5来源壳聚糖酶的碳水化合物结合模块32 (carbohydrate binding module 32,CBM32)作为壳聚糖结合模块。其次,将大肠杆菌表达纯化后的融合蛋白CBM32-GFP与dit1Δ孢子共孵育,通过GFP荧光定位以及荧光强度验证CBM32在体外与孢子壁具有较好的亲和能力;CBM32-GFP在dit1Δ孢子内的荧光定位与结合能力证明了其在孢子内能够与孢子壁紧密结合;最后,以MEL1替换GFP应用到新型展示体系中,与只表达MEL1的孢子相比,CBM32-MEL1孢子酶活不仅提高了68.65%,最高酶比活力达到460.59 U/g DCW (dry cell weight,菌体干重),重复使用能力也得到了显著提高;此外,该体系提高了MEL1的稳定性和可操作性。【结论】本研究首次提出利用结合模块来构建一个新型酿酒酵母孢子表面展示体系,为真核来源的多糖基化位点修饰以及多亚基结构蛋白提供了可靠的细胞表面展示平台,为实现工业化应用孢子固定化酶提供了理论依据。