兔抗人胸腺/淋巴细胞免疫球蛋白药代动力学检测方法的建立

目的建立兔抗人胸腺/淋巴细胞免疫球蛋白(rabbit anti-human thymus/lymphocyte immunoglobulin, r-ATG)药代动力学检测方法并验证, 用于检测临床用药后患者血清中r-ATG的浓度。方法采用鼠抗兔IgG包被酶标板, 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作为二抗, 建立双抗体夹心ELISA检测人血清中r-ATG的含量, 并对该方法进行线性范围、平行性、重复性、中间精密度、准确性、专属性及不同时间参考品标准曲线浓度的回收率稳定性验证。用建立的方法对5例患者的临床血清样本(血样)进行检测并进行药代动力学分析。结果以0.25 μg/ml为起始浓度, 稀释倍数在21~29之间的参考品浓度与吸光度值呈S曲线, 决定系数(R^(2))>0.99, 回收率在90%~110%;参考品与3份血样的线性方程斜率的变异系数(coefficient of variation, CV)<10%, R^(2)>0.99, R^(2)的CV<5%, 平行性较好;重复性和中间精密度CV<15%, 回收率均在90%~110%;准确性验证结果平均回收率均在80%~120%;注射药物的患者血清与健康人血清以及未注射药物的患者血清之间的差异有统计学意义, t值分别为32.607、21.949, P<0.01;参考品在2~8 ℃放置16个月时标准曲线各浓度的回收率均值均在90%~110%, 且各浓度不同时间点回收率相对标准偏差<15%;5例患者均在给药第5天血药浓度达到最高值, 平均半衰期为(6.5±5.3) d。结论建立的方法具有良好的稀释线性和样本间的平行性、重复性、中间精密度、准确性、专属性, 且参考品标准曲线各浓度在不同时间点的回收率稳定性良好, 可以用于r-ATG临床用药后血清浓度的检测。

人外周血白细胞处理后CD分子的变化及免疫原性

目的检测人外周血中白细胞培养后主要CD分子的变化,验证其作为免疫原制剂的可行性。方法以白细胞滤盘为原料,对比分析白细胞滤盘中淋巴细胞培养前后CD2、CD3、CD4、CD8、CD44、CD45、CD98、CD99、CD107a、CD38、CD25、CD56、CD147、CD50、CD49d、CD82、HLA-ABC共17种CD分子的变化,并与胸腺细胞、Jurkat细胞和外周血细胞进行对比。用培养的淋巴细胞进行免疫原的制备,进行E玫瑰花环抑制试验和淋巴细胞毒试验,制定并验证免疫程序。结果白细胞滤盘中的淋巴细胞培养后,检测的17种CD分子均未发生丢失,其中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+阳性率分别从培养前的59.81%、32.73%、22.15%变为98.80%、18.32%、75.31%。免疫原性分析结果显示,第3次免疫后6~15 d血浆抗体的E玫瑰花环抑制试验100%合格,9 d时淋巴细胞毒试验合格率最高。另用10头猪进行了免疫程序的验证,结果显示效价100%合格。结论人外周血白细胞处理后作为免疫原制剂可行。

抗人T细胞猪免疫球蛋白药代动力学检测方法的建立、验证及应用

目的建立抗人T细胞猪免疫球蛋白(porcine anti-human T cell immunoglobulin,p-ATG)药代动力学检测方法并验证,以检测用药后患者血清总p-ATG浓度。方法采用兔抗猪IgG F(ab′)2包被酶标板、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG作为二抗,建立人血清p-ATG含量的双抗体夹心ELISA,并验证该方法的标准曲线拟合范围、平行性、精密度、准确度、专属性。用建立的方法对13例患者的不同用药剂量的临床血样进行检测并分析药代动力学。结果从0.44μg/ml起始浓度稀释21~27倍的参考品浓度与吸光度值之间呈现S曲线,决定系数(R2)大于0.99,回收率为89.91%~112.96%;平行性样品斜率与参考品斜率变异系数(coefficient of variation,CV)绝对值<10%,R2>0.99,R2的CV<5%;板间、板内曲线CV<10%;重复性CV<10%,回收率为94.23%~101.80%;加标回收率均在99.87%~104.94%之间;输注p-ATG后患者血清与健康人血清以及输注前患者血清p-ATG浓度间差异有统计学意义(F=1.48,P<0.05)。20、25、30 mg剂量用药患者的血样中,p-ATG半衰期分别为20.6、16.6、16.2 d。结论建立的p-ATG药代动力学检测方法具有良好的重复性、准确度及专属性,可以用于p-ATG临床用药后血清浓度的检测。