响应面法优化LAMP反应冻干保护剂配方的研究

目的筛选出适用于甲流病毒环介导等温扩增技术(LAMP)的最佳冻干保护剂组合,建立起可在室温下长时间储存的甲流病毒核酸检测体系,为甲流现场快速检测和分级诊疗提供技术支持。方法以LAMP核酸扩增活性为评价指标,在单因素试验的基础上利用三因素三水平的响应面法,探究冻干保护剂(海藻糖、牛血清白蛋白和甘露醇)对LAMP试剂的保护效果并优化冻干保护剂的组合。结果采用Box-Behnken试验结果进行回归模型拟合,LAMP试剂的保护剂最佳配方组合为7.64 wt%海藻糖、0.43 wt%牛血清白蛋白和0.85 wt%甘露醇。经真空冷冻干燥且加入保护剂后的LAMP试剂将以脱水形式贮存,可在常温下长期保持活性,使用时加水复溶即可。为了检验保护剂的稳定性,真空冷冻干燥后的LAMP试剂分别置于25℃和37℃下贮存,第0天、4天、8天、12天、16天、20天取出分别进行LAMP扩增活性检测。添加最优保护剂组合的LAMP冻干试剂其核酸扩增活性远大于添加单一保护剂或未添加冻干保护剂组。结论添加最优保护剂组合能够延长LAMP试剂的贮存时间和保持试剂的稳定性。

基于环介导等温技术检测人甲流H1N1病毒的响应面优化分析

目的为了建立人甲型流感H1N1病毒的环介导等温扩增(LAMP)体系,本研究以H1N1病毒核酸扩增效率为指标,通过响应面分析优化探讨LAMP检测H1N1流感病毒的最佳反应条件。方法根据Box-Benhnken响应设计原理,对影响LAMP反应关键因素(甜菜碱浓度、引物浓度、反应温度)进行三因素三水平响应面法优化。同时选取60例确诊甲流临床核酸样本和60例健康受试者核酸样本,分别采用聚合酶链反应(PCR)技术和LAMP检测技术进行比对评估(评估指标包括灵敏度、特异性、准确度)。结果响应面回归模型能较好地预测LAMP检测效果与甜菜碱浓度、引物浓度和反应温度之间的关系,经过优化LAMP反应体系提高检测灵敏度和缩短反应时间。同时与PCR检测结果相比,LAMP检测实现100%的灵敏度、98.9%的特异性和99.2%的准确度,检测下限可达100 copies/ml。结论本研究建立的H1N1甲流LAMP检测是一种高效、灵敏、特异性高且不需要复杂设备的检测方法,适用于基层医疗卫生机构或居家自测,对季节性甲流病毒监测及暴发时应急检测具有重要意义。

人工智能病理诊断和云服务关键技术及其在宫颈癌筛查中的应用

宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤,早诊早治可有效降低发病率和死亡率.我国计划2030年前实现适龄妇女宫颈癌筛查率达70%.然而,我国面临适龄女性人数众多与医疗资源短缺之间的矛盾,加上地区间医疗资源分布不平衡,亟待创新医疗服务模式,提高服务效率和效果.

三种常用宫颈癌检查方法比较

目的比较常规细胞学、高危型HPV-DNA病毒测定及DNA倍体分析方法在诊断宫颈癌及癌前病变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)的优缺点。方法 374名妇女做宫颈活检前进行了宫颈细胞常规细胞学诊断、高危型HPV-DNA病毒测定和DNA倍体分析。用宫颈刷刷取宫颈细胞,每个样本制成二张液基薄层玻片,一张经巴氏染色用于常规细胞学诊断(TBS),另一张经Feulgen染色做DNA倍体分析,剩余样本做HC2-HPV-DNA检测。宫颈活检样本进行组织病理诊断。结果 374例宫颈活检样本中发现167例宫颈炎,92例CIN1,63例CIN2,37例CIN3和15例宫颈浸润癌。在259例宫颈炎和CIN1病例中,高危型HPV检测201例为阴性,58例为阳性;DNA倍体分析发现有异倍体细胞的病例为40例,219例为阴性;TBS诊断ASCUS及以上级别的病例30例,229例为正常。在115例CIN2、CIN3和宫颈浸润癌中,高危型HPV病毒测定阳性为98例,阴性为17例;DNA倍体分析阳性为93例,阴性为22例;TBS诊断ASCUS及以上级别的有79例,正常为36例。诊断CIN2及以上级别的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值,高危型HPV测定分别为85.2%、77.6%、62.8%和92.2%;DNA倍体分析分别为80%、84.6%、69.9%和90.9%;TBS诊断为68.7%、88.4%、72.5%和86.4%。结论在诊断宫颈高级别癌前病变(CIN2和CIN3)和宫颈癌上,HPV-DNA病毒方法敏感性高,特异性低;常规细胞学方法敏感性低,特异性高;DNA倍体分析方法正好介于二种方法之间。三种方法均有优缺点,具体运用应根据实际情况而定。

宫颈细胞DNA倍体异常伴ASCUS病变的临床病理学意义

目的结合DNA倍体分析和The Bethesda system(TBS)诊断结果,研究意义未明的不典型鳞状细胞(atypical squamous cells of undermined significance,ASCUS)伴有DNA倍体异常病例的预后及病理改变。方法南京市妇幼保健院33188名妇女行宫颈癌筛查。用宫颈刷取宫颈上皮细胞,经固定后,离心机制成两张玻片,一张行巴氏染色作TBS诊断;另一张Feulgen染色行DNA倍体分析,其中539例妇女均进行阴道镜检查和组织病理学检查。结果 539例活检病例中,诊断为宫颈炎296例,宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia)1级(CIN1)132例,CIN2 64例,CIN3 38例和浸润癌9例。CIN2或CIN2以上级别病变111例,其中96例有DNA倍体异常(86.5%)。251例常规细胞学诊断为ASCUS,其中无非整倍体细胞168例中发现8例CIN2(4.7%)的病变;而伴有非整倍体细胞的83例中发现17例CIN2或CIN2以上级别的病变(20.5%),两组百分比之间用配对c2检验,有显著差异。活检病例中常规细胞诊断30例非典型鳞状细胞不除外高级别鳞状上皮内病变(atypical squamous cells,cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion,ASC-H),9例无非整倍体细胞病例中有2例病理诊断为CIN2(22%);21例伴有非整倍体细胞有19例病理诊断为CIN2或CIN2以上级别的改变(90.4%)。两组百分比之间用配对c2检验有统计学上差异。结论 ASCUS、ASC-H伴有DNA倍体异常患者发展为CIN2及以上级别病变风险较高。

用DNA倍体分析方法判断宫颈癌前病变的发展趋势

目的探讨宫颈鳞状上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)的DNA倍体变化是否可判断CIN病变发展趋势的生物标志物。方法 76例妇女宫颈细胞做DNA倍体分析,同时这些妇女行宫颈组织活检,做组织病理学检查和宫颈组织Ki67、P16免疫组化。DNA倍体分析异常组分为3个级别,发现1~2个异倍体细胞为I级、3~10个异倍体细胞为II级、10个以上异倍体细胞为III级。测定出Ki67和P16阳性细胞在宫颈上皮分布区域(%)。结果 76例组织病理结果为49例宫颈炎和CIN1、27例CIN2、CIN3和浸润癌。诊断CIN2及以上级别疾病的敏感性和特异性:DNA倍体I级分别为92.5%和42.8%,II级分别为77.7%和75.5%,III级分别为45.9%和93.8%。CIN2、CIN3病变中,DNA倍体III级的病例中,Ki67和P16在宫颈上皮阳性分布区域显著性比DNA倍体I级和II级的阳性分布区域增大,即DNA异倍体细胞愈多,Ki67和P16阳性蛋白表达愈多。结论与Ki67和P16一样,宫颈DNA异倍体细胞作为一个重要生物标记物,可用于判断CIN病变的发展趋势。

几种主流恒温扩增技术及其优化策略进展

2019年末爆发的新型冠状病毒(2019-nCoV)疫情严重威胁着人类健康与经济发展,遏制疫情发展的关键是如何准确、快速地完成2019-nCoV病毒检定。虽然2019-nCoV检测主流技术平台为PCR聚合酶链反应,但恒温扩增技术因其无需昂贵设备、操作流程简便、即时检验、结果判读简易可视化等优势,逐步成为某些紧急场景PCR替代技术。本文综述了六种主流恒温扩增技术,即依赖核酸序列扩增、滚环核酸扩增、链置换扩增、解旋酶依赖扩增、重组酶聚合酶扩增、环介导恒温扩增,并从等温核酸扩增原理、优化反应策略及其应用领域进行了阐述。