1145例捐精者筛查结果与未完成捐精流程原因分析

目的:分析人类精子库的接待和招募工作质量,以及精源不足的问题。方法:本研究对湖北省人类精子库2011年9月至2012年4月的1 145例捐精者的招募工作进行统计,对捐精者淘汰原因进行分析,并对合格而未捐精者进行面谈和电话回访。结果:1 145例捐精者中,学生551例(48.12%),社会人群594例(51.88%);参与第一次精液质量检查后未继续捐精503例(43.93%),其中学生202例(占学生筛查人数36.67%),社会人群301例(占社会筛查人群50.67%);两次精液质量筛查均不合格432例(37.73%);实验室检查不合格45例(3.93%),其中解脲脲原体阳性16例;通过精液筛查和实验室检查的合格捐精者165例(14.41%),未能完成整个捐精流程21例(12.73%),最终完成捐献流程的捐精者144例。结论:人类精子库普遍存在筛查合格率低、捐精完成率低,如能让捐精者有效地完成捐精流程,有利于提高捐精者合格率及降低精子库的运行成本;通过接待时的面谈和电话回访对他们不能按流程完成捐精的原因进行分析表明,精子库需加强招募工作及捐精者第一次来精子库时的讲解,提高捐精者对精子库的满意度和信任度,以提高捐精者完成捐精流程率。

甲基化DNA免疫沉淀-荧光实时定量PCR检测人精浆游离DNA睾丸和附睾特异性甲基化启动子

目的:建立检测精浆游离DNA(cfsDNA)启动子甲基化水平的甲基化DNA免疫沉淀-荧光实时定量PCR(MeDIP-qPCR)方法。方法:提取精液参数正常(6例)和输精管结扎(6例)男性的cfsDNA,将两组不同个体的cfsDNA分别进行混合,超声处理后形成DNA片段,通过MeDIP分离甲基化DNA片段,然后用qPCR方法检测启动子甲基化水平。结果:精液参数正常组的PRAME、PEG10、MORC1、GML、HOXA5、DNMT3L、SNURF、MSH4、DAZ1和CLPB启动子甲基化水平分别为14.93%、2.64%、0.69%、2.66%、17.50%、21.10%、5.98%、2.28%、13.50%和3.86%,明显低于输精管结扎组的121.25%、73.62%、16.25%、42.90%、76.74%、112.40%、59.79%、25.85%、91.90%和64.53%。其中,PRAME、MORC1、GML、HOXA5、DNMT3L、SNURF、MSH4和DAZ1等8个启动子MeDIP-qPCR的检测结果与启动子甲基化芯片结果一致。结论:通过MeDIP-qPCR方法可以定量检测到cfsDNA中的特异性启动子甲基化,为确定cfsDNA中睾丸和附睾特异性甲基化启动子提供了有效途径。

血清抗缪勒管激素在梗阻性和非梗阻性无精子症鉴别诊断中的应用价值

目的:通过测定正常生育男性、梗阻性无精子症(OA)患者、非梗阻性无精子症(NOA)患者血清抗缪勒管激素(AMH)水平,探讨其是否作为血清标志物鉴别诊断OA和NOA。方法:选择2018年9月至2019年4月男性不育门诊就诊的患者作为研究对象,采用化学发光免疫法测定正常生育组(n=43)、OA组(n=14)、NOA组(n=45)患者血清中的AMH、抑制素B、FSH水平,经阴囊B超测量睾丸体积。并对正常生育组、OA组和NOA组均进行AMH、抑制素B、FSH、睾丸体积的统计分析。结果:AMH正常生育组[(8.13±3.95) ng/ml]和OA组[(8.51±4.77) ng/ml]均明显高于NOA组[(5.65±3.13) ng/ml,P<0.05],抑制素B正常生育组[(127.38±40.50) pg/ml]和OA组[(131.25±52.30) pg/ml]均明显高于NOA组[(25.98±16.29)pg/ml,P<0.01],FSH正常生育组[(4.22±3.23) IU/L]和OA组[(4.54±2.09) IU/L]均明显低于NOA组[(19.87±13.09)IU/L,P<0.01];正常生育组与OA组AMH、抑制素B、FSH差异无统计学意义(P>0.05)。Pearson相关分析结果显示,抑制素B与AMH呈正相关(r=0.326,P=0.01),与FSH呈负相关(r=-0.662,P<0.01);FSH与AMH呈负相关(r=-0.468,P<0.01);睾丸体积与AMH呈正相关(r=0.339,P<0.01),与抑制素B呈正相关(P<0.01,r=0.733),与FSH呈负相关(P<0.01,r=0.597);精子浓度与抑制素B呈正相关(r=0.522,P<0.01),与FSH呈负相关(r=-0.421,P<0.01),与睾丸体积呈正相关性(r=0.605,P<0.01)。结论:AMH可作为睾丸精子发生的血清标志物之一,并单独或与抑制素B和FSH三者联合用于OA和NOA的鉴别诊断。

ALOX5、ALOX5AP基因多态性与髓系白血病易感性的关系

目的:探讨花生四烯5-脂氧合酶基因(arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)rs2029253,rs2228064和rs2228065位点以及5-脂氧合酶激活蛋白基因(5-lipoxygenase activating protein gene,ALOX5AP)rs10507391和rs4769874位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)与髓系白血病发病风险的相关性。方法:经医院伦理委员会批准、患者知情同意,选取150例髓系白血病患者为髓系白血病(ML)组,134例健康人群为对照组。提取基因组DNA,采用聚合酶链反应及限制性片段长度多态技术(PCR-RFLP)联合PCR产物直接测序法检测ALOX5、ALOX5AP基因5个位点的基因型。结果:ALOX5基因rs2029253位点在ML组和对照组中的A等位基因频率分别为43.0%和34.3%,而等位基因G的频率分别为57.0%、65.7%;基因型AA、AG和GG在ML组中的分布频率分别为32.2%,21.5%和46.3%,而在对照组中的分布频率分别为15.7%,37.3%和47.0%。基因型AA和等位基因A可能增加髓系白血病的发病风险(OR=2.26,95%CI:1.43-4.56,P<0.05;OR=1.44,95%CI:1.02-2.03,P<0.05);基因型AG与等位基因G可能降低对髓系白血病的易感性(OR=0.46,95%CI:0.27-0.78,P<0.01;OR=0.69,95%CI:0.50-0.98,P<0.05)。而ALOX5基因rs2228064、rs2228065位点多态性在ML组与对照组间的分布差异无统计学意义(P>0.05)。ALOX5AP基因rs10507391位点等位基因A在髓系白血病组和对照组中频率分布分别为30.7%和36.2%;基因型AA、AT和TT在ML组中分布频率分别为1.3%,58.7%和40.0%,在对照组中的分布频率分别为9.7%,53.0%和37.3%;基因型AA可能降低髓系白血病的发病风险(OR=0.13,95%CI:0.03-0.57,P<0.05);而ALOX5AP rs4769874位点基因型与等位基因分布频率在ML组与对照组间的分布差异无统计学意义(P>0.05)。结论:ALOX5 rs2029253位点基因型AA、AG和等位基因A、G以及ALOX5AP rs4769874位点AA基因型与髓系白血病发病的遗传易感性相关。

真核表达CatSper1用于筛选有效siRNA的体外实验研究

目的构建pEGFP-N1-CatSper1重组质粒,在真核细胞中表达CatSper1,利用化学合成siRNA抑制小鼠CatSper1基因的表达,并筛选抑制效果最佳的siRNA序列。方法利用重组PCR克隆小鼠CatSper1全长cDNA,构建到真核表达载体中。生物信息分析软件校正结果,获得三条针对雄性小鼠CatSper1的siRNA序列,合成后分别与重组质粒pEGFP-N1-CatSper1共转染到小鼠成神经瘤N2a细胞株中,通过观察EGFP荧光强度、实时定量聚合酶链反应和WesternBlot等方法,分析干扰效果,筛选能显著降低N2a细胞中外源性CatSper1表达量的siRNA序列。结果成功克隆小鼠CatSper1基因的全长cDNA片段(2,061 bp),并构建到pEGFP-N1表达载体中。三个siRNA干扰组的CatSper1 mRNA和蛋白表达与空白对照组相比均下降,其中以靠近3′端的siRNA干扰作用更为明显,阴性对照siRNA组未引起CatSper1 mRNA和CatSper1蛋白表达明显变化。结论在小鼠神经瘤N2a细胞株中成功表达外源性CatSper1蛋白,并筛选出有效的siRNA,为深入研究CatSper1功能及用于避孕提供参考。

基于不孕不育女性予以宫腔镜下输卵管插管通液治疗的临床效果分析

目的探究采取在宫腔镜下进行输卵管插管通液治疗的不孕不育治疗效果。方法选取2017年6月至2018年6月在武汉同济生殖医学专科医院就诊的68例不孕不育女性患者作为研究对象,对患者按照治疗方法进行分组,分成对照组和实验组两组,每组34人。两组患者基本情况相同,对照组采取常规治疗方法,实验组组采用宫腔镜的治疗方法。结果经过手术治疗后两组患者的输卵管畅通情况均有所改善,同时,从治疗效果来看,实验组效果要好于对照组,妊娠成功率也高于对照组。结论采取宫腔镜下进行输卵管插管通液治疗的方法能够有效治疗不孕不育女性输卵管的堵塞病症,值得在临床应用中推广。

构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒

旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。

低促性腺激素性闭经致不孕不育患者治疗方法临床观察

目的探寻治疗低促性腺激素性闭经导致的不孕不育患者的方法。方法选择2017年10月~2018年10月在我院就诊的60例不孕不育患者作为研究对象,按照治疗方法分组,每组30例。采取不同的方法对两组患者进行治疗。结果两组患者在治疗后都取得了一定的治疗效果,其中实验组的妊娠成功率有了大幅提高,达到了86.67%,对照组的妊娠成功率仅为53.33%,从其他身体指标来看,实验组也优于对照组。结论采取人绒毛膜促性腺激素、尿促性素和人工周期相结合的方式能够有效改善低促性腺激素性导致的不孕不育患者的状况,取得良好的临床治疗效果。

男性不育症患者生殖道解脲支原体感染与细胞因子、自身抗体的相关性研究

目的:探讨男性不育症生殖道解脲支原体(UU)感染与细胞因子水平及自身抗体的相关性。方法:按WHO的标准对生育组和不育组(包括少精组、弱精组及无精组)进行精液常规分析,解脲支原体培养;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血液和(或)精浆IL-2、IL-6、TNF、AcAb的水平;采用混合抗球蛋白反应试验(MAR)法检测AsAb;采用间接免疫荧光(IFA)法检测ANA。结果:与生育组比较,无精组血液和精浆中IL-2、IL-6、TNF-α水平显著增高,其差异具有统计学意义(P<0.01);弱精症组血液及精浆IL-6水平与生育组相比差异有统计学意义(P<0.05),血液及精浆IL-2、TNF-α水平与生育组相比差异无统计学意义(P>0.05);少精症组血液和精浆中IL-2及血清IL-6与生育组相比差异有统计学意义(P<0.05);在生殖道解脲支原体的培养中不育各组的阳性率均高于生育组;在AsAb、AcAb、ANA的检测中,不育症各组的阳性率均高于对照组,用IFA检测ANA阳性结果中发现,ANA核型均为胞浆颗粒/核颗粒型,而弱精症血清以及不育症各组精浆中未检测出AcAb、ANA。结论:男性生殖道UU感染可诱生细胞因子,打破细胞因子间的平衡,引起体内自身抗体的产生;同时也会影响精液质量,与男性不育密切相关;对男性不育症患者上述指标的检测,并探讨感染、细胞因子及自身抗体之间的相关性,可为不育症的诊断与治疗提供实验依据。

CFTR基因第8内含子5T多态与中国汉族男性先天性双侧输精管缺如的相关性研究

目的研究囊性纤维化转运调节因子（cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator，CFTR）基因第8内含子中的5T等位基因多态性与中国汉族男性先天性输精管缺如（congenitalbilateralabsenceofvasdeferens，CBAVD）的相关性。方法选择33例CBAVD患者和99例不存在CBAVD的无精症患者，提取其基因组DNA，用聚合酶链反应扩增CFTR基因的第8内含子，对产物进行TA克隆后测序。结果33例CBAVD男性患者中有17例存在5T多态，异常比例为51．5％，其中有3例患者在2个等位基因上同时为5T多态，占5T多态的17．6％，占总体异常比例的9．1％。99例男性无精症患者对照中有9例存在5T多态，异常比例为9．1％，未发现2个等位基因同时为5T多态者。结论中国汉族男性CBAVD的发生和CFTR基因5T突变有明显的相关性，5T突变阴性的CBAVD患者不排除存在CFTR基因其他突变的可能性。

输精管结扎对中老年男性性腺功能的远期影响

目的探讨输精管结扎术后对中老年男性性腺功能的远期影响。方法随机抽取有输精管结扎史的167例中老年男性,按照结扎年限不同分成10年组（10~19年）、20年组（20~29年）、30年组（≥30年）。按1∶1匹配未结扎、有生育史的167例中老年男性作为对照组。测量研究对象血清总睾酮（total testosterone,TT）、游离睾酮（free testosterone,c FT）、雌二醇（estradiol,E2）、性激素结合球蛋白（sex hormone binding globulin,SHBG）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone,LH）水平,简体中文版老年男性症状量表（CN-AMS）得分,比较两组间及不同结扎年限间的差异。结果结扎组与对照组在血清TT、c FT、E2、SHBG、FSH、LH水平及CN-AMS得分比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结扎10年组、20年组与对照组的各指标比较差异无统计学意义（P〉0.05）;结扎30年组血清c FT明显低于对照组（P〈0.05）,血清TT、E2、SHBG、FSH、LH水平及CN-AMS得分比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论输精管结扎术后对中老年男性性腺功能远期没有明显影响。

不同年龄段男性血清总睾酮和游离睾酮水平分析

了解不同年龄段男性血清总睾酮（total testosterone,TT）和游离睾酮（calculated free testosterone,c FT）水平的变化。方法按不同年龄段将研究对象分为6个组。分别测定血清TT、性激素结合球蛋白（sex hormone binding globulin,SHBG）,计算出血清c FT,分析年龄与男性血清TT和c FT水平的关系。结果不同年龄组间血清TT水平60~〈70岁组与30~〈40岁、40~〈50岁组比较差异有统计学意义（P〈0.05）,其他各组间差异无统计学意义（P〉0.05）。血清c FT、SHBG水平除20~〈30岁、30~〈40岁两组间比较差异无统计学意义（P〉0.05）,其他各组间两两比较差异均有统计学意义（P〈0.05）。血清TT,SHBG与年龄呈正相关,而血清c FT与年龄呈负相关（P〈0.05）。结论随着年龄的增长,血清TT水平呈现微弱升高趋势,而血清c FT水平在40岁以后出现明显下降。作为中老年男性性腺功能低下诊断指标,血清c FT水平具有更好的敏感性。

输精管结扎对中老年前列腺症状和患前列腺癌风险的影响

目的探讨输精管结扎对中老年前列腺症状和患前列腺癌风险的影响。方法调查北京、湖北、江苏309名已行输精管结扎的中老年人,同时按1∶2比例选取618名年龄匹配的未结扎中老年人作为对照,以填写调查问卷方式计算国际前列腺症状评分表(international prostate symptom score,IPSS)评分,留取外周血进行前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)和游离PSA检测,比较两组间差异。结果在所调查的人群中,经矫正教育程度等因素后,输精管结扎组和非结扎组之间IPSS评分、PSA水平、游离PSA和游离PSA百分比比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论输精管结扎术不影响前列腺的症状,也不提高前列腺癌的风险。

胰岛素样因子3应用于男性迟发性性腺功能减退诊断的可行性研究

目的分析胰岛素样因子3(insulin like factor 3,INSL 3)应用于男性迟发性性腺功能减退(late onset hypogonadism,LOH)诊断的可行性。方法选取中老年男性,间隔1个月抽取空腹晨血2次,分析INSL 3在血清中的平均浓度及其稳定性;依据男性LOH的诊断标准,分析患者组与正常对照组之间血清中INSL 3的浓度是否存在差异。结果接受重复抽血的中老年男性44人,血清INSL 3的浓度均值为(1.86±0.64)ng/m L,经过1个月的间隔期血清中INSL 3的浓度变化差异无统计学意义(P>0.05)。在患者组与正常对照组之间血清中INSL 3的浓度差异有统计学意义(P<0.05)。进一步研究发现血清INSL 3浓度与促黄体生成素(luteotropic hormone,LH)、总睾酮、游离睾酮之间存在相关性(P<0.05),而与绝育术、烟酒、糖尿病、高血压、冠心病、体质量指数和中老年男性症状量表(aging males’symptoms scale,AMS)评分之间无相关性(P>0.05)。结论初步研究提示血清INSL 3与男性性腺功能状态紧密相关且表达稳定,有望用于LOH的诊断。

烟酒和体质量指数对AMS评分的影响

目的分析烟酒和体质量指数(body mass index,BMI)对中老年男性症状量表(aging males’symptoms scale,AMS)评分的影响。方法采用整群及年龄分层抽样方法随机选取受访者,结合调查问卷结果分析烟酒和BMI对AMS评分的影响。结果接受调查问卷的中老年男性1 245人,其中同时具有合格血样和有效问卷的城区174人、平原农村790人、山区农村233人,共计1 197人。统计分析发现饮酒和BMI对AMS评分无显著影响;在烟龄10年之内,随着烟龄的增加性功能症状会有逐步的改善,性功能症状平均得分由9.3逐步降至8.4;但烟龄超过10年后,性功能症状开始恶化,其评分均值随着烟龄逐步达到9.8;即使采取戒烟措施,性功能症状的评分均值仍会达到10.6,提示长期吸烟造成的性功能损害可能具有不可逆性。结论饮酒和BMI对AMS评分无显著影响;吸烟对AMS评分,特别是其中的性功能症状部分有显著影响,长期吸烟造成的性功能损害可能具有不可逆性。

衣原体属与支原体属感染及细胞因子水平和男性不育的相关性研究

目的探讨男性不育症患者精液沙眼衣原体(Ct)、解脲脲支原体(Uu)感染与细胞因子水平的相关性,研究男性不育病因。方法按WHO标准对生育组和不育组患者进行精液常规、衣原体抗原检测和支原体属培养;采用ELISA法检测精浆IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α的水平。结果不育症各组精液Ct、Uu感染及Ct+Uu混合感染率显著高于生育组,感染率少精组、弱精组、无精组Ct分别为27.78%、28.20%、26.83%,Uu分别为41.67%、43.59%、46.34%,生育组Ct、Uu分别为5.71%、8.57%,差异有统计学意义(P<0.05);不育症组中Ct、Uu感染患者IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α水平较未感染者显著增高(P<0.05);与生育组比较,少精组、无精组精浆中IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α水平显著增高(P<0.05),而弱精组中精浆IL-2、TNF-α水平与生育组相比差异无统计学意义,精浆IL-6、IL-8水平与生育组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论男性生殖道Ct、Uu感染与男性不育有密切的关系,由感染所致的男性不育可能与细胞因子参与的免疫反应有关。

鹿藿正丁醇提取物体外杀精作用及机制探讨

目的研究鹿藿正丁醇提取物（11-ButanolextractofRhynchosiavolubilisLour，BERVL）的体外杀精子作用及机制。同时观察该提取物体外对嗜酸乳酸杆菌的影响，初步评估BERVL作为杀精子剂的可行性和安全性。方法体外杀精子实验以生理盐水为阴性对照，壬苯醇醚（nonoxynolum-9，N-9）为阳性对照，显微镜下观察浓度为250mg／ml，125mg／ml，100mg／ml，90ms／ml，62．5mg／ml的BERVL对人精子活力的影响；体外抑茵实验用试管稀释法和琼脂稀释法；体外杀精子机制探讨：用伊红Y水试验和Hoechst33342／PI荧光双染，显微镜下检测精子膜功能和精子凋亡。结果BERVL在90mg／ml浓度组：体外杀精实验，原地活动精子百分率为（4．730±3．231）％；体外抑菌试验，对嗜酸乳酸杆菌抑制率为32．96％-35．70％；伊红Y水溶液染色，精子头部未着色百分率为（7．846±4．706）％。Hoechst33342／PI荧光双染．凋亡精子百分率为（4．977±2．267）％，死精子百分率为（90．111±4．509）％。结论90mg／ml为BERVL较安全理想的体外杀精浓度。BERVL有显著的体外杀精子作用，可能与破坏精子膜和加速精子凋亡及死亡有关。