靶向转染色素上皮源性因子治疗大鼠子宫内膜异位症的研究

目的:探索免疫纳米脂质体介导色素上皮源性因子(PEDF)质粒转染对子宫内膜异位症大鼠模型的治疗效果。方法:将新生血管内皮细胞表面高表达的VEGFR-2作为靶向位点,用其特异性配体寡肽ATWLPPR修饰纳米脂质体,反向装载PEDF表达质粒,制备一种新型免疫纳米脂质体载药系统ATWLPPR-IML-PEDF。以子宫内膜片异位移植法建立EM大鼠模型,随机分为对照组(n=6,移植内膜数为32)和脂质体转染组(n=6,移植内膜数为33),于造模后次日分别给予生理盐水0.1ml或ATWLPPR-IML-PEDF脂质体溶液(含PEDF质粒5mg/kg体重)0.1ml尾静脉注射。造模后3周测量病灶大小。检测病灶中PEDF融合蛋白水平,并以qRT-PCR及Western blot法检测VEGF mRNA及蛋白表达量。结果:体外实验表明,ATWLPPR-IML-PEDF能高效转染VEGFR-2阳性细胞,转染率达(91.80±0.03)%。动物实验表明,ATWLPPR-IML-PEDF一次尾静脉给药即可显著抑制子宫内膜片的异位生长,异位内膜萎缩消失率为18.18%(6/33),其余EM病灶平均体积显著低于对照组[(18.92±0.88)mm3vs(78.40±1.93)mm3,P<0.001]。脂质体转染组PEDF蛋白表达量增高的同时,EM病灶中VEGF mRNA及蛋白的表达量亦显著降低(P<0.001)。结论:载药免疫纳米脂质体ATWLPPR-IML-PEDF可有效抑制大鼠EM病灶生长,为EM的抗新生血管治疗提供了一种简便、特异、高效的新手段。

色素上皮源性因子对大鼠子宫内膜异位病灶的治疗价值

目的:在大鼠模型基础上,探索重组色素上皮源性因子(rPEDF)对子宫内膜异位病灶(EM)的治疗价值和作用机制。方法:建立大鼠EMs模型,随机分为对照组(仅给予PBS,n=5)、治疗Ⅰ组(建模后立即开始给予rPEDF)及治疗Ⅱ组(建模后1周开始给予rPEDF)。根据给药剂量,治疗Ⅰ、Ⅱ组均设立10μg/kg、25μg/kg、50μg/kg 3个亚组(各亚组n=5),隔日一次尾静脉注射。造模后3周测量异位病灶体积,RT-PCR及Western blot法检测血管内皮生长因子(VEGF)及FasL mRNA及蛋白表达水平。评估rPEDF对EM大鼠及非EM大鼠动情周期、排卵、着床等生殖生理参数的影响及内膜异位病灶的治疗价值。结果:治疗Ⅰ组中25μg/kg rPEDF即可显著减小异位病灶体积,并随剂量增加呈量效关系,治疗Ⅱ组给药剂量达50μg/kg时才具有显著差异;且同等治疗剂量下,治疗Ⅰ组的病灶体积显著小于治疗Ⅱ组(P均<0.01)。给药剂量为25μg/kg时,各治疗组的VEGF表达水平较对照组显著降低,并呈量效关系;且相同治疗剂量下,治疗Ⅰ组的VEGF表达水平显著低于治疗Ⅱ组(P均<0.01);给药剂量为50μg/kg时,各治疗组FasL mRNA及蛋白的表达水平显著高于对照组(P均<0.01),治疗Ⅰ组、Ⅱ组间无显著差异(P>0.05)。50μg/kg rPEDF对大鼠动情周期、排卵无影响,并可显著改善EM大鼠着床率(P<0.05)。结论:补充外源性rPEDF可有效抑制EM模型大鼠内膜异位病灶的发生发展,病变早期给药效果更好,最佳给药剂量为50μg/kg,且该剂量不会对大鼠生殖参数造成不良影响。

双酚A亚慢性暴露对雌性小鼠卵巢储备功能的影响

目的探讨低剂量双酚A(BPA)经口亚慢性暴露对雌性小鼠卵巢储备功能的影响。方法64只5周龄SPF级C57BL/6小鼠随机分为4组,分别5、50、500μl/mlBPA溶液(BPA低、中、高剂量组)和单纯玉米油(对照组)按体重给予灌胃。28 d后小鼠框内静脉取血,ELISA检测血清抗苗勒氏管激素(AMH)及雌激素(E_2)水平。处死小鼠获取卵巢组织,荧光定量PCR检测AMH mRNA的表达,免疫组化检测AMH蛋白的表达。结果与对照组相比,BPA低、中、高组血清AMH、E_2激素水平、卵巢组织AMH基因及蛋白的表达量均呈现下降趋势,BPA低组及BPA高组下降显著,差异有统计学意义。结论BPA对小鼠卵巢存在非单一剂量效应,亚慢性暴露于低剂量BPA可以引起小鼠卵巢储备功能下降。

卵泡输出率对不孕患者卵巢反应性及妊娠结局的预测价值

目的探讨在体外受精-胚胎移植(IVF-ET)中,卵泡输出率(FORT)对不孕患者卵巢反应性及临床妊娠率的预测价值。方法选择2010年1月1日至2014年12月31日,在武汉大学中南医院生殖医学中心进行IVF-ET治疗的768例不孕患者为研究对象。本研究中,FORT为注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)当日,直径为14～22mm排卵前卵泡数(PFC)与直径为3～8mm窦卵泡计数(AFC)的比值。根据其FORT值,将其分为低FORT值组(n=255,FORT值小于所有受试者FORT值的第33位百分位数,即FORT值<0.36),中FORT值组(n=277,FORT值处于所有受试者FORT值的第33～67位百分位数,即FORT值为0.36～0.67),高FORT值组(n=236,FORT值大于所有受试者FORT值的第67位百分位数,即FORT值>0.67)。采用回顾性分析方法,采集3组患者的一般临床资料及控制性促排卵相关指标。采用单因素方差分析,对于3组患者的年龄、人体质量指数(BMI)、基础卵泡刺激素(FSH)、AFC、促性腺激素(Gn)总量、Gn使用时间、注射hCG当日雌二醇水平、PFC、获卵数、MⅡ卵子数、移植胚胎数等进行比较。采用最小显著差异法(LSD)法,对3组患者AFC进一步进行两两比较。采用Kruskal-Wallis H秩和检验,对3组患者不孕年限、基础促黄体激素(LH)、基础雌二醇水平等进行比较。采用χ~2检验,对3组患者不孕原因构成比、优质胚胎率、胚胎种植率、临床妊娠率、活产率等进行比较。采用Pearson相关性分析,对不孕患者FORT与其获卵数、可利用胚胎数、优质胚胎数、年龄、基础FSH水平、基础雌二醇水平的相关性进行分析。对于不孕患者临床妊娠率的影响因素,进行多因素非条件logistic回归分析。本研究遵循的程序符合武汉大学中南医院伦理委员会所制定的伦理学标准,得到该委员会批准(审批文号:2017109)。结果 (1)3组患者的年龄、BMI、不孕年限、不孕原因构成比等一般临床资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)3组患者的基础FSH、基础LH、基础雌二醇水平分别整体比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。低、中、高FORT值组患者的AFC分别为(15.2±3.2)个、(14.3±3.7)个和(13.8±3.5)个,3组比较,差异有统计学意义(F=56.547,P<0.001)。(3)3组患者注射hCG当日雌二醇水平、PFC、获卵数、MⅡ卵子数、可利用胚胎数、双原核受精率、优质胚胎率、胚胎种植率、临床妊娠率和活产率比较,差异均有统计学意义(F=64.974、215.869、26.344、22.904,H=59.625,χ~2=32.985、16.532、21.324、14.319、12.644,均为P<0.001)。3组患者的Gn总量、Gn使用时间、移植胚胎数比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(4)不孕患者中,FORT与获卵数(r=0.286,P<0.001),可利用胚胎数(r=0.327,P<0.001)及优质胚胎数(r=0.252,P<0.001)均呈正相关关系;但是,FORT与年龄(r=0.021,P=0.063)、基础FSH水平(r=-0.019,P=0.169)及基础雌二醇(r=0.023,P=0.088)之间无相关性。(5)对不孕患者临床妊娠率影响因素进行多因素非条件logistic回归分析的结果显示,FORT是不孕患者临床妊娠率的独立影响因素(OR=1.023,95%CI:1.003～1.043,P=0.027)。结论 FORT可作为不孕患者卵巢窦卵泡对FSH的反应性、妊娠结局的有效预测指标。但是,因为本研究仅为回顾性研究,FORT对不孕患者卵巢反应性及妊娠结局的预测价值,仍有待大样本、多中心、前瞻性研究进一步证实。

年龄对不育男性精子DNA碎片率和精子形态的影响

目的:评估年龄对男性不育患者精子DNA碎片率(DFI)及精子形态的影响。方法:回顾性分析2014-2018年本院生殖中心7067例精子形态学参数分析及2015-2017年1808例精子DFI分析的结果。根据患者年龄将其分为4组:≤25岁,26~35岁,36~45岁,及>45岁。采用单因素方差分析正常形态精子百分率、精子头部畸形百分率以及精子DFI的组间差异,并分析年龄与精子形态学参数及DFI的相关性。结果:随着年龄的增加,正常形态精子百分率和精子头部畸形率降低而精子DFI升高。≤25岁,26~35岁,36~45岁,及>45岁组的正常形态精子百分率分别为(6.14±2.39)%、(6.12±2.48)%、(5.95±2.32)%和(5.48±2.04)%,除≤25岁与26~35岁、≤25岁与36~45岁组间差异无显著性外,其余分组两两间差异均有显著性;各组精子头部畸形率分别为(86.55±5.07)%、(86.16±5.08)%、(85.82±5.27)%和(85.56±5.19)%,除≤25岁与26~35岁、26~35岁与>45岁、36~45岁与>45岁组间差异无显著性外,其余分组两两间差异均有显著性;各组精子DFI分别为(10.44±4.32)%、(12.26±6.84)%、(14.01±7.59)%和(20.08±10.14)%,各组两两间差异均有显著性。不育男性年龄与正常形态精子百分率(r=-0.07,P<0.01)、精子头部畸形率(r=-0.03,P<0.01)显著负相关,而与精子DFI(r=0.26,P<0.01)显著正相关。结论:不育男性的年龄影响DNA完整性和精子正常形态,随着年龄增加,DFI升高而正常形态精子百分率降低,且年龄与DFI及精子正常形态百分率均显著相关。

子宫内膜异位症中miR-556-3p的异常表达及其与血管内皮生长因子的关系

目的探索micro RNA-556-3p(mi R-556-3p)在子宫内膜异位症中的表达模式及其与血管内皮生长因子(vascular endothelium growth factor,VEGF)的关系。方法子宫内膜异位症患者15例作为研究组,分别收集在位内膜、卵巢异位内膜及腹膜异位内膜;无子宫内膜病变的妇女16例,收集子宫内膜组织作为对照组。Taqman real-time PCR检测上述组织中mi R-556-3p的水平,Western Blot法检测组织中VEGF蛋白含量,并分析mi R-556-3p与VEGF表达水平之间的相关性。结果与对照组相比较,内异症患者在位内膜及腹膜异位病灶中mi R-556-3p水平显著降低(P<0.001),而VEGF含量在内异症在位内膜、卵巢异位囊肿或腹膜异位内膜中均显著升高(P值分别为<0.001、0.02、<0.001);与内异症组在位内膜相比较,卵巢异位病灶中mi R-556-3p显著升高(P<0.001),腹膜异位病灶中mi R-556-3p的表达量则显著降低(P<0.001),而VEGF显著升高(P<0.001);异位症组在位内膜及腹膜异位病灶中mi R-556-3p与VEGF蛋白的表达量呈显著负相关(r值分别为-1.026、-1.819,P值分别为0.01、0.04)。结论内膜组织中mi R-556-3p表达异常可能导致VEGF蛋白表达失调,参与子宫内膜异位症的发生发展。

双酚A干扰人卵巢颗粒细胞雌二醇生成的机制

目的:研究双酚A(BPA)对人卵巢颗粒细胞细胞色素P450芳香化酶(P450arom)和雌二醇(E2)表达的影响机制。方法:提取人卵巢颗粒细胞进行体外培养,细胞鉴定采用免疫细胞化学法,CCK-8增殖实验分析细胞体外增殖活力。予以不同浓度BPA(0,0.1,1,10,100mg/L)或BPA+PPAR-γ抑制剂GW9662 1μmol/L处理处理人卵巢颗粒细胞,ELISA法测定各组E2浓度,获取细胞沉淀,RT-PCR法测定P450arom mRNA表达。结果:人卵巢颗粒细胞体外培养第3-5天达增殖分裂高峰,FSHR免疫细胞化学鉴定显示阳性染色定位于细胞膜和细胞质,细胞纯度达95%以上,ELISA及RT-PCR结果显示当BPA浓度为0.1mg/L时,P450arom mRNA及E2生成较空白对照组增加(P<0.05),当BPA浓度为1,10,100mg/L时,P450arom mRNA及E2生成逐渐减少(P<0.05),加入GW9662后,P450arom mRNA及E2表达量较单独BPA处理组增高(P<0.05)。结论:BPA干扰人卵巢颗粒细胞E2的生成,该干扰可能通过PPAR-γ核受体途径进行。

卵泡液中双酚A浓度与卵巢储备功能下降的相关性

目的:初步探讨卵泡液中双酚A(BPA)浓度与卵巢储备功能下降(DOR)的相关性。方法:于取卵日收集行体外受精/卵胞质内单精子显微注射(IVF/ICSI)的DOR患者和非DOR患者的卵泡液,酶联免疫吸附(ELISA)技术测定54例DOR患者及67例非DOR患者卵泡液中BPA浓度及激素水平,采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。结果:DOR组较非DOR组卵泡液中BPA浓度显著升高[(234.048±81.736)ng/L vs(193.300±67.225)ng/L,P<0.01];DOR组较非DOR组卵泡液中抗苗勒氏管激素(AMH)[(555.689±74.224)pg/ml vs(587.178±77.731)pg/ml,P<0.05]及雌二醇(E2)[(209.720±31.556)pg/ml vs(221.845±32.632)pg/ml,P<0.05)水平低;且卵泡液中BPA与AMH及E2水平有弱负相关性(rBPA&AMH=-0.312,P<0.05;rBPA&E2=-0.290,P<0.05)。结论:DOR患者卵泡液中BPA浓度显著偏高,卵泡液BPA浓度与卵泡液AMH和E2浓度呈弱负相关性;BPA可能通过调节卵泡液中激素水平来影响卵巢储备功能。