结直肠癌细胞IL-4/Stat6信号传导活性与调节基因差异性表达相关性研究

目的:IL-4介导的Stat6信号传导活性在人细胞之间有差异,称为Stat6活化表型。旨在探讨Stat6活化表型及其产生的分子学基础。方法:结直肠癌细胞株HT-29与Caco-2的Stat6活化表型用EMSA半定量法测定。Stat6通路调节因子基因水平的表达用RT-PCR法检测。蛋白水平的表达用Western blotting法检测。结果:EMSA分析表明,HT-29为高活化表型(Stat6high)而Caco-2为零活化表型(Stat6null)。RT-PCR分析显示,与Stat6highHT-29比较,Stat6nullCaco-2癌细胞高表达负调节基因SOCS1和SHP1,而低表达正调节因子PP2A催化亚单位编码基因PP2CA和PP2CB。Westernblotting分析法证实Caco-2癌细胞高表达SOCS1和SHP1蛋白。结论:Stat6通路正、负调节基因的表达失衡可能是产生不同Stat6活化表型的分子机制之一。

放射抗拒细胞模型基因表达异常对比研究

目的研究已建立的放射抗拒细胞对比模型基因表达谱差异，初步分析放射抗拒的相关基因。方法Hep-2细胞重复照射12次后，传代培养至细胞形态、增殖状态稳定，筛选得到抗拒细胞株Hep-2R。从亲代Hep-2细胞和Hep-2R细胞提取总RNA，选用2张各含基因14000个的基因表达谱cDNAV芯片检测。筛选2张芯片差异相同的基因，计算Hep-2R细胞与Hep-2细胞基因表达的比值。结果Hep-2R与Hep-2的放射生物学参数分别为SF2=0．6798，D0=3．24、α=0．2951、β=0．0363，及SF2=0．4148、Do=2．06、α=0．1074、β=0．0405，Hep-2R获得了明显的抗拒性（SF2的x^2=63．957，P〈0．001）。Hep-2R细胞中上调基因22个，下调基因19个，主要基因类别为：蛋白质合成基因11个、DNA损伤修复基因9个、细胞结构基因6个、凋亡相关基因3个、癌基因与抑癌基因2个、细胞周期基因2个、代谢基因2个、信号通路受体基因2个、其他类基因4个。端粒保护蛋白基因POT1表达在所有上调基因中变化最显著（上调3．348倍）。结论不同放射敏感性的对比模型细胞基因表达谱不同，POT1基因变化最显著，有可能成为放射增敏的靶点。

分泌型重组多肽sPD-1-CellⅠ(P／C-1)调节免疫细胞功能活性及抗肿瘤效应的研究

目的构建双结构域重组多肽sPD-1-Cell I(P／C-1)分泌型真核表达载体,并研究体内外表达重组多肽在调节免疫细胞功能活性及抗肿瘤方面的作用和机制。方法用PCR方法分别扩增出编码PD-1胞外结构域的cDNA与编码CH50 Cell I结构域的cDNA,3片段连接法插入分泌型真核表达载体pSecTagA中,获得真核表达载体pP／C-1;脂质体介导体外转染BHK细胞,G418筛选出阳性克隆,RT-PCR及免疫印迹检测重组多肽P／C-1的表达,MTT法检测表达产物对脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞杀伤活性的影响,建立小鼠H22肝细胞癌移植瘤模型,裸DNA肌肉注射法分别于体内转染sPD-1、CH50和P／C-1基因,观察并比较各处理因素对小鼠的肿瘤生长的抑制作用。结果酶切及测序鉴定结果表明重组多肽P／C-1真核表达载体构建成功,在BHK细胞培养上清中检测到重组多肽P／C-1的表达,后者能显著增强脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞对H22细胞的杀伤作用,体内实验表明,P／C- 1转染对肿瘤生长的抑制作用强烈而持久,显著优于sPD-1和CH50治疗组。结论重组多肽P／C-1真核表达载体构建成功,表达产物P／C-1兼有sPD-1和CH50的生物学功能,能够激活巨噬细胞和脾淋巴细胞,发挥二者协同抗肿瘤作用,从而将非特异性和特异性抗肿瘤免疫有机地结合起来,为肿瘤基因治疗提供新的思路。

喉癌细胞hTERT启动子介导基因治疗研究

目的研究喉癌细胞中端粒酶活性、端粒酶逆转录酶（hTERT）表达和hTERT启动子活性的关系，以及hTERT启动子介导喉癌基因治疗的可行性。方法将含hTERT启动子的质粒转染不同放射敏感性喉癌细胞（Hep2和Hep2R），通过报告基因评价启动子活性，RT-PCR检测hTERT mRNA表达，PCR—ELISA法检测端粒酶活性。构建质粒phTERTp-HRP，用RT-PCR和酶活性分析评价辣根过氧化物酶（HRP）表达，以克隆形成实验评价phTERTp-HRP／吲哚乙酸（IAA）对克隆形成率和放射敏感性的影响。结果Hep2R的端粒酶活性、hTERT mRNA表达水平和hTERT启动子活性分别是Hep2的1．37、1．43和1．81倍。hTERT启动子活性与hTERT mRNA表达水平和端粒酶活性之间显著正相关（P〈0．01）。转染phTERTp-HRP后，Hep2R细胞中HRP mRNA表达和HRP活性水平分别是Hep2细胞的2．1倍和1．8倍。0．5mmol／L IAA处理后，SERSF2分别为1．24（Hep2R）和1．20（Hep2），无IAA和有IAA组存活曲线参数α分别为0．020、0．090（Hep2R）和0．042、0．099（Hep2）。结论hTERT启动子可用于不同放射敏感性喉癌细胞的基因治疗。hTERTp—HRP／IAA基因治疗有望用于喉癌细胞的靶向杀伤和放射增敏。