Fas相关死亡结构域蛋白荧光真核表达载体的构建及其鉴定

目的:构建真核表达载体pEGFP-N1-FADD并检测其在结肠癌细胞株SW480中的表达.方法:设计人FADD特异性引物,从人结肠癌细胞SW480细胞提取总RNA,通过RT-PCR方法获取人FADD全长cDNA,定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1.应用PCR、酶切和DNA测序进行鉴定,确认后转染人结肠癌细胞SW480.G418抗性筛选获得FADD稳定表达细胞克隆,应用Westernblot检测FADD的表达水平.结果:测序及酶切鉴定证明获得人全长FADD基因,FADD基因正确插入pEGFP-N1中,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白在SW480细胞中的稳定表达,Westernblot检测结果显示稳定转染pEGFP-N1-FADD的细胞FADD表达水平增高,是未转染细胞的2.34倍.结论:成功构建真核表达载体pEGFP-N1-FADD,并且在SW480细胞中稳定表达.