日本血吸虫成虫培养细胞SDH和LDH细胞化学研究

目的 研究日本血吸虫成虫培养细胞琥珀酸脱氢酶 (SDH)和乳酸脱氢酶 (LDH)含量、分布及变化规律 ,了解日本血吸虫成虫培养细胞的能量代谢类型。方法 将虫龄 2 6d的日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上 ,培养于RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清附加常量抗生素的培养基中 ,定时运用Pearson法进行SDH和LDH染色 ,用Olympus-BH2 显微镜观察并拍照 ,用HPIAS - 2 0 0 0图像分析仪测量其含量 ,并作统计分析。结果 日本血吸虫成虫培养细胞均具有SDH和LDH活性 ,两者均分布在细胞质内。培养 1d细胞的SDH和LDH活性最强 ,随着培养时间延长 ,其活性逐渐减弱 ,其中SDH活性下降较快 ,培养 5d大部分细胞SDH活性已极弱 ;而LDH活性下降则较缓 ,培养 5 6d细胞仍具LDH活性。结论 体外培养的日本血吸虫成虫细胞的能量代谢类型与成虫相似 ,既存在三羧酸循环需氧型呼吸链 ,也具有无氧糖酵解 ,但以无氧糖酵解为主。

丙烯硫脲对日本血吸虫酚酶抑制作用的组织化学研究

目的 通过组织化学方法研究丙烯硫脲对小鼠体内、体外日本血吸虫成虫酚酶 (phenol oxidase,PO)活性的抑制作用。方法 将 4 2 d日本血吸虫活成虫置于含 2 5 mmol/L 邻苯二酚的磷酸盐缓冲液 (p H6 .8)中 ,2 8℃下孵育 30 min,取出虫体置载玻片上 ,加 2滴含 0 .1%戊巴比妥钠的 PBS溶液 ,置 L eica荧光显微镜下 ,分别在普通光照和紫外光激发下观察酚酶在虫体内的组织学定位。体外抑制实验时 ,加底物前先将成虫置于含 5mm ol/L 丙烯硫脲的 PBS溶液中 ,2 8℃下孵育 10 min;体内抑制实验时 ,在小鼠感染日本血吸虫尾蚴 2 0 d后 ,按30 0 m g/kg隔日 1次腹腔注射丙烯硫脲。结果 体外抑制实验组雌虫卵黄腺及子宫内虫卵卵壳和雄虫体壁表层的桔黄色荧光或赭褐色颜色反应均基本消失 ;体内抑制实验组雌虫子宫内未见虫卵或虫卵样物质 ,仅见大量泥沙样卵黄颗粒 ,其荧光或颜色反应也基本消失。结论 通过一种更灵敏的显示酚酶活性的组织学定位方法 ,观察到不仅雌虫含有酚酶 ,雄虫也有酚酶活性。证明丙烯硫脲对血吸虫成虫的酚酶活性有明显的抑制作用 。

肝基质与MNNG对日本血吸虫成虫培养细胞糖细胞化学作用的研究

目的研究肝基质与甲基硝基亚硝基胍（MNNG）对日本血吸虫成虫培养细胞糖类物质的影响。方法日本血吸虫成虫细胞分别接种于普通小盖玻片（实验1组）和铺敷有肝基质的小盖玻片上（随机分为实验2组和3组），培养于含20％小牛血清及常量抗生素的RPMI-1640常规培养基中。培养第4d，实验1组和3组细胞分别在含3μg/ml MNNG的常规培养基中培养48h，彻底清洗后继续用常规培养基培养；实验2组细胞用不含MNNG的常规培养基处理相同时间。培养第4w。均换用含5％小牛血清的低血清培养基培养。培养第5～7w，每周取各组细胞进行高碘酸雪夫（PAS）染色和唾液淀粉酶处理后的PAS染色，观察培养细胞内糖类物质的含量及分布变化。取培养第6w（MNNG作用后第5w）的各组染色细胞，用HPIAS-2000图像分析仪测定细胞内代表糖含量的光密度，并作统计学分析。结果实验3组细胞与实验1、2组比较，PAS染色显示的四种类型细胞其着色均显著增强，淀粉酶处理后的PAS染色显示细胞内糖原含量增多，差异均具显著性（P〈0．01）。培养过程中，第二类细胞数目逐渐增多，体积增大；分裂细胞增多。这种状况在MNNG处理后第5w最为明显。结论肝基质和MNNG联合可显著增强日本血吸虫培养细胞的糖代谢和分裂增殖能力，二者具协同作用能力。

日本血吸虫酚氧化酶的电泳及酶活性的研究

目的 观察日本血吸虫成虫酚氧化酶 ( phenol oxidase,PO)的酶谱及其活性。方法 将 42 d活成虫置含 0 .0 5 %戊巴比妥钠的 RPMI16 40培养基中 2 3℃孵育 8h后 ,分别收集雌、雄成虫 ,匀浆、超声粉碎、高速离心取上清 (含 PO) ,再进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE)及酶染色后分析其酶谱 ;同时在紫外分光光度计下检测前后 2个时点的 A488值 ( A1,A2 ) ,PO活性相对值 =( A2 - A1) / ( min· m g样品蛋白 ) ,其活性值用每分钟每毫克蛋白 A488变化值表示。设立酚酶抑制剂 (丙烯基硫脲 )组 ,在该组成虫匀浆上清中预先加入丙烯基硫脲以观察其对酚氧化酶活性的抑制效果。结果 雌虫及雄虫均表现为迁移率相同的一条主带 ;但雄虫的酶带显色反应比雌虫弱。日本血吸虫雌虫及雄虫的酚氧化酶相对活性分别为 0 .16 5 m in- 1· mg- 1和 0 .0 80 5 min- 1· m g- 1 ;加入酚酶抑制剂后 ,酶活性被明显抑制。终浓度为 5 mm ol的丙烯基硫脲对成虫酚酶活性的抑制率为 85 .0 3%。当丙烯基硫脲终浓度达 2 5 m mol时 ,酚酶活性被完全抑制。结论 不仅雌性成虫含有日本血吸虫酚氧化酶 ,而且雄性成虫也含有少量的酚氧化酶且两者酶分子相同。雄性成虫含有的少量酚氧化酶的生理意义有待于进一步研究。

日本血吸虫培养细胞SDH、AKP和ACP的组织化学观察

目的 探讨日本血吸虫成虫培养细胞琥珀酸脱氢酶 (SDH)、碱性磷酸酶 (AKP)和酸性磷酸酶 (ACP)的组织化学变化。方法 应用组织化学染色方法显示日本血吸虫成虫培养细胞SDH、AKP和ACP。结果 日本血吸虫成虫培养细胞均具SDH、AKP、ACP活性 ,体积较大的细胞在胞膜附近和鞭毛细胞的鞭毛部位SDH活性最强 ;圆颗粒细胞、三角扇形细胞及合胞体的AKP活性细胞质较细胞核弱 ,团簇状排列的细胞主要分布在细胞质 ,而鞭毛形细胞则集中于细胞核和鞭毛部位 ;ACP的活性均较强 ,尤其是体积较大的培养细胞 ,活性部位集中分布在核周或弥散分布在细胞质中。结论 日本血吸虫培养细胞SDH、AKP和ACP的组化染色可做为简便易行、快速敏感的细胞培养条件优劣的评价指标。

甲基硝基亚硝基胍对日本血吸虫成虫培养细胞磷酸酶影响的研究

目的 研究甲基硝基亚硝基胍 (MNNG)对日本血吸虫成虫培养细胞碱性磷酸酶 (AKP)和酸性磷酸酶 (ACP)活性的影响。方法 将虫龄 2 6 d的日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上 ,在RPMI- 16 40含 2 0 %小牛血清附加常量抗生素的常规培养基中培养第 7天时 ,随机分为实验组和对照组 ,实验组用含浓度为 3μg/ ml MNNG的常规培养基处理 48h,对照组用不含 MNNG的常规培养基处理同样时间 ,随后换用常规培养基培养 3周 ,当再换用含 5 %小牛血清的培养基培养 1周时 ,分别用 Gomori钙钴法和 Gom ori硫化铅法对两组培养细胞进行 AKP和 ACP细胞化学染色 ,用Olym pus BH- 12显微镜观察并拍照 ,用 HPIAS- 2 0 0 0图像分析仪测量其含量 ,并作统计分析。结果 实验组培养细胞的 AKP、ACP活性明显高于对照组培养细胞的活性 (P<0 .0 1)。结论 MNNG能增强日本血吸虫成虫培养细胞 AKP、ACP的活力 ,对培养细胞有促生长或 /和诱导其转化的作用。

肺生物基质及鼠尾胶对日本血吸虫培养细胞影响的研究

目的 研究细胞外基质 (ECM)对日本血吸虫培养细胞生存、生长的影响 ,佐证 ECM有利于培养细胞的生存、生长。方法 将虫龄 2 1d的日本血吸虫细胞接种于预先涂有肺生物基质、鼠尾胶的培养瓶和小盖玻片上常规培养 ,分别在光镜及扫描电镜下观察、拍照 ,并运用酶细胞化学方法进行培养细胞的乳酸脱氢酶 (L DH)染色。对照组未涂生物基质。结果 与对照组相比 ,实验组细胞饱满 ,弹性好 ,立体感强 ,存活时间长 ,L DH活性强 ,对高温具一定的耐受性 ;尤其是肺基质中培养的细胞 ,酶活性最强 ,培养 6 0 d的细胞仍观察到具有分裂能力。结论 ECM能改善日本血吸虫培养细胞生存、生长的微环境。实验组间比较 。

肝基质 鼠尾胶对日本血吸虫培养细胞AKP和ACP影响的研究

目的 研究肝基质、鼠尾胶对日本血吸虫成虫培养细胞碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性的影响,筛选适合日本血吸虫细胞培养的基质。方法 将虫龄28d的日本血吸虫成虫细胞,接种于预先铺敷有肝基质和鼠尾胶的小盖玻片上常规培养,未铺敷基质者作对照。运用酶细胞化学方法,分别于培养5、14、21、35d对日本血吸虫成虫培养细胞进行AKP和ACP染色,显微镜下观察并拍照,图像分析仪测定其含量,并作统计分析。结果 铺敷的基质不同,培养细胞的AKP和ACP活性不同。AKP、ACP着色深浅均按对照组、鼠尾胶组、肝基质组依次加深。定量分析显示,培养14d内,肝基质组与鼠尾胶组细胞AKP活性明显高于对照组(肝基质组P<0.01;鼠尾胶组P<0.05);两基质组培养细胞之间差异也有显著性(P<0.05)。培养21d后,肝基质组细胞AKP活性分别高于鼠尾胶组和对照组(P<0.01);后两者培养细胞之间的AKP活性无明显差异(P>0.05)。培养5d细胞的ACP活性,肝基质组与鼠尾胶组明显高于对照组(P<0.05),两基质组相互比较差异无显著性(P>0.05);培养14d后,各组之间两两比较均有差异(P<0.05),肝基质组培养细胞ACP活性最强,鼠尾胶组次之,对照组最弱。结论 肝基质较为适合日本血吸虫培养细胞的存活与生长。

日本血吸虫培养细胞核仁组织区相关嗜银蛋白的研究

目的 通过研究日本血吸虫成虫与童虫培养细胞核仁组织区相关嗜银蛋白(AgNORs)含量及β-巯基乙醇对培养细胞AgNORs的影响,探讨AgNORs能否作为评价日本血吸虫培养细胞增殖的指标以及β-巯基乙醇对培养细胞的促增殖作用。方法 联合法培养虫龄分别为18d和24d的日本血吸虫童虫与成虫,将童虫细胞随机分成对照组和实验组,对照组细胞与成虫细胞使用常规培养基培养,实验组在常规培养基中加入50μmoL/L β-巯基乙醇和1mmoL/L丙酮酸钠。培养第5d,运用胶银法染色,使用HPIAS-2000图像分析系统,计算培养细胞核内AgNORs颗粒数,测定银染颗粒面积与核面积的百分比和平均光密度。结果 日本童虫培养细胞(对照组)的AgNORs颗粒数目、颗粒面积与核面积百分比、平均光密度均高于成虫培养细胞。统计学分析显示,两者之间的AgNORs颗粒数日,银染颗粒面积与核面积百分比、平均光密度两两比较均有统计学差异(P<0.01或P<0.05);实验组培养细胞与对照组比较,AgNORs颗粒数目明显增多颗粒面积与核面积百分比、平均光密度均显著升高。统计学分析可知,两组细胞三组参数之间均有统计学差异(P<0.01或P<0.05)。结论 AgNORs可作为评价日本血吸虫培养细胞增殖的一个简便、敏感的指标。日本血吸虫童虫培养细胞较成虫培养细胞更具增殖潜能;

日本血吸虫培养细胞磷酸酶细胞化学的动态变化

目的 :研究体外培养的日本血吸虫成虫细胞碱性磷酸酶 (AKP)和酸性磷酸酶 (ACP)活性的变化规律。方法 :将虫龄 2 6d的日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上 ,培养于RPMI16 4 0含 2 0 %小牛血清附加常量抗生素的培养基中 ,培养 7,14 ,2 1,35和 4 9d时 ,分别运用改良的Gomori钙 -钴法和Gomori硫化铅法进行AKP和ACP染色。结果 :随着培养时间延长 ,日本血吸虫成虫培养细胞的AKP和ACP活性均渐减弱。培养 2 1d后 ,所有培养细胞的AKP活性开始减弱 ;培养至 4 9d ,AKP阴性反应细胞所占比例增大 ,但仍有较多细胞具AKP活性 ;而ACP活性在培养 14d时 ,有的细胞显著增强 ,有的却明显减弱 ;培养至 35d ,所有细胞的ACP活性减弱 ,并出现ACP阴性反应的空泡状细胞 ;至 4 9d ,大部分细胞的ACP反应为阴性。结论 :随着培养时间延长 ,日本血吸虫培养细胞的AKP、ACP活性均减弱 ,AKP、ACP活性的强弱可以作为评价血吸虫细胞培养条件优劣的指标 ;培养细胞呈分批、逐步退化。

日本血吸虫酚氧化酶抗原诱导免疫对病鼠肝脏病理变化的影响

目的 观察日本血吸虫酚氧化酶天然蛋白抗原诱导免疫对病鼠肝脏的病理变化。方法 将 4 2 d活成虫置于含 0 .0 5 %戊巴比妥钠的 RPMI 16 4 0培养基中孵育 8h后洗净 ,匀浆 ,超声粉碎、低温高速离心 ,将含酚氧化酶的上清液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,嗣后分别在两侧切取胶宽约 1cm进行酶染色 ,解剖刀准确切下相应的未染色的凝胶。冻干后碾成粉末 ,高速电动匀浆成浆糊状 ,冷浸过夜。高速离心得上清即为日本血吸虫酚氧化酶粗抗原。设立 3组进行免疫实验 :实验组、佐剂对照组和空白对照组。初次免疫后第 2、4周 ,各重复 1次加强免疫 ,最后 1次免疫 10 d后用新鲜逸出尾蚴 (4 0± 1)条 /鼠进行攻击感染。 4 2 d剖杀动物 ,观察日本血吸虫感染小鼠肝脏的病理变化。结果 与对照组相比 ,酚氧化酶免疫实验组小鼠肝脏表面较光滑 ,隐约可见少量灰白色小点 ,肝色泽略带灰色 ,质地较软 ;压片观察小鼠肝脏内虫卵集聚数量明显减少 ,且以未成熟虫卵为主。肝脏内伴少量肝细胞坏死 ,细胞浸润不明显 ,可见较多未成熟卵周围无肉芽肿反应。小鼠肝组织内虫卵肉芽肿的平均直径和面积比对照组小鼠肝组织内虫卵肉芽肿的平均直径和面积明显减小 ,两组间差异有非常显著性 (P<0 .0 1)。结论 日本血吸虫酚氧化酶蛋白具抗原性 。

鼠胚胎成纤维细胞饲养层及其与肝基质联合对日本血吸虫童虫培养细胞LDH、ACP影响的研究

目的以乳酸脱氢酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)为评价指标,研究鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层及其与肝基质联合对日本血吸虫童虫培养细胞代谢的影响。方法实验分MEF与肝基质联合组(后简称联合组)、MEF组、肝基质组和对照组4组。联合组与肝基质组预先铺敷肝基质,MEF组和对照组未铺敷肝基质,将虫龄21d的日本血吸虫童虫细胞分别接种于预先铺敷或未铺敷肝基质的小盖玻片上。肝基质组和对照组细胞培养于RPMI1640含20%小牛血清附加常量抗生素的常规培养基中,联合组与MEF组的细胞培养于有MEF饲养层的常规培养基中。培养第7d,运用酶细胞化学方法对日本血吸虫童虫培养细胞进行LDH、ACP染色,OlympusBX51显微镜下观察并拍照,HIPAS2000图像分析仪测定其含量,并作统计分析。结果4组童虫培养细胞其LDH、ACP活性不同。LDH、ACP着色按联合组、MEF组、肝基质组、对照组依次变浅。定量分析显示,培养细胞的LDH含量,各组之间两两比较差异具显著性(P<0.01);联合组、MEF组、肝基质组培养细胞的ACP含量两两比较存在显著差异(p<0.01),联合组、MEF组与对照组之间比较差异具统计学意义(P<0.01),而肝基质组与对照组之间差异无显著性(P>0.05)。结论MEF饲养层能促进日本血吸虫童虫培养细胞的代谢,并能与肝基质协同促进培养细胞代谢。

日本血吸虫成虫培养液中氨基酸及葡萄糖含量的动态变化

目的 观察培养过程中日本血吸虫成虫细胞培养液中氨基酸 (AA)、葡萄糖 (Gluc)及甘油三酯 (TG)含量的动态变化。方法 用氨基酸自动分析仪、自动生化分析仪分别测定培养液在培养 0～ 6d过程中AA、Gluc及TG含量变化。结果 精氨酸 (Arg)、苏氨酸 (Thr)、蛋氨酸 (Met)、赖氨酸 (Lys)及Gluc含量有不同程度下降 ;天门冬氨酸 (Asp)、丙氨酸 (Ala)及游离氨 (Amm)有明显上升 ;TG变化不明显。结论 在日本血吸虫成虫细胞培养液中适当增加Arg、Thr、Met、Lys和Gluc ,同时减少Asp和Ala的含量 。

日本血吸虫培养细胞整装内质网膜系统形态及基质对其结构的影响

目的 研究日本血吸虫培养细胞整装内质网膜系统的三维结构及细胞外基质 (ECM)对其的作用。方法 用高锰酸钾作固定剂 ,制备日本血吸虫培养细胞整装内质网膜系统标本 ,扫描电镜下观察。结果 日本血吸虫培养细胞的内质网膜系统由膜性小管、小泡相互连接构成小型扁囊样网络结构。基质中细胞的内质网膜系统较对照组发达、丰富 ;基质的种类不同 ,培养细胞内质网膜系统的形态各异。鼠尾胶中细胞多由膜性小管和小泡构成 ,其网眼数目较少 ,可见伪足样结构 ;伪足较短 ,也由膜性小管或小泡构成管囊状网络。肺基质中细胞几乎均为小管 ,小泡极少 ;网眼和伪足数目增多 ,伪足呈针状。肝基质中细胞的内质网膜系统与肺基质中的相似 ,但网眼和伪足数目更多 ,伪足细长 ,呈纤维状。结论 ECM可明显影响日本血吸虫培养细胞的内质网膜系统形态 ;ECM的种类不同 。

日本血吸虫培养细胞内糖类物质的动态变化及肝基质对其的影响

目的研究日本血吸虫成虫培养细胞内糖类物质的动态变化以及肝基质培养对其的影响。方法将虫龄为32d的日本血吸虫成虫细胞随机分为2组,实验1组(普通组)细胞接种于普通小盖玻片上,实验2组(肝基质组)细胞接种于预先铺敷有肝基质的盖玻片上,细胞培养基为RPMI-1640(含20%小牛血清附加常量抗生素)。每周取各组细胞进行高碘酸雪夫(PAS)染色和淀粉酶处理后的PAS染色,观察培养细胞内糖类物质的水平及分布变化。在培养第1周和第5周分别取2组染色细胞,用HPIAS-2000图像分析仪测定细胞内代表糖水平的A值,并做统计学分析。结果随着培养时间的延长,实验1组的4种类型细胞的糖水平逐渐减少,细胞内不含糖原;而实验2组细胞的糖原和糖类物质逐渐增加。培养第1周,2组细胞几乎均不含糖原,但实验1组细胞的糖水平高于实验2组,差异有统计学意义(u=7.10,P<0.01)。培养第5周,实验1组细胞糖原仍甚少,而实验2组细胞的糖原水平明显增加(u=9.32,P<0.01);并且实验2组细胞的糖水平显著高于实验1组细胞(u=16.89,P<0.01)。培养过程中,实验1组未见分裂细胞,但实验2组可观察到分裂细胞。结论日本血吸虫培养细胞内糖类物质随培养时间的延长逐渐减少;肝基质能增强培养细胞合成糖物质和生长增殖能力。

肝基质对日本血吸虫培养细胞生长的影响

目的研究肝基质对日本血吸虫培养细胞形态、增殖的影响。方法联合法将虫龄为21d的日本血吸虫童虫细胞接种于预先铺敷有肝基质(实验组)和未铺敷肝基质(对照组)的小盖玻片上,培养于常规培养基中,用高碘酸雪夫(PAS)法染色培养细胞,Olympus-BH2显微镜下观察并拍照;并将接种第3天的实验组和对照组培养细胞用胶银法进行核仁组织区相关嗜银蛋白(AgNORs)染色,HPIAS-2000图像分析仪测定AgNORs平均光密度值进行图像分析。结果实验组中的培养细胞其细胞质突起和分裂细胞增多,AgNORs的平均光密度值显著高于对照组细胞(P<0.01)。实验组的细胞分裂方式除常见的一分为二方式外,还观察到一分为三的多极分裂方式;而对照组未观察到分裂细胞。结论肝基质可明显影响日本血吸虫培养细胞的形态,显著促进培养细胞的增殖。

MNNG诱导日本血吸虫成虫培养细胞的扫描电镜观察

目的 观察甲基硝基亚硝基胍 (MNNG)对不同培养时间日本血吸虫成虫培养细胞作用的变化 ,确定培养细胞发生转化进而增殖的最佳诱导时间。 方法 将 2 3～ 2 8d虫龄的日本血吸虫成虫制成细胞悬液 ,接种于小盖玻片上 ,培养于含 2 0 %小牛血清及常量抗生素的RPMI 164 0常规培养基中。将接种培养第 4、5、6、7、8d的细胞分别设为 5个实验组及其相应的对照组。实验组用含终浓度为 3 μg/mlMNNG的常规培养基处理 48h ,对照组用不含MNNG的常规培养基处理相同时间 ,嗣后换用常规培养基培养 4周 ,再改用含 5 %小牛血清的培养基继续培养。MNNG诱导后每周取各组培养细胞固定、制样 ,每组随机取 3张小盖玻片进行电镜扫描观察 ,连续取样 11周。 结果 经MNNG诱导的日本血吸虫成虫培养细胞表面出现形态各异的结构 ,既有与对照组类似的表面较光滑和有乳突的培养细胞 ,也有表面光滑如玻璃珠状的细胞 ,还有具长纤突、微嵴、皱褶、微绒毛、蜂窝和仙人球状等形态的细胞 ;实验 1组培养至第 5周即出现大量分裂细胞。 结论 MNNG诱导培养第 4d的日本血吸虫成虫细胞培养至第 5周可发生转化而出现分裂、增殖。

日本血吸虫酚氧化酶天然蛋白分子特征的初步分析

目的 初步分析日本血吸虫酚氧化酶 (phenol oxidase,PO)天然蛋白分子的分子量及其亚基组成。方法 将 4 2 d龄活成虫置于含 0 .0 5 %戊巴比妥钠的 RPMI16 4 0培养基中 2 3℃孵育 8h后 ,PBS(p H6 .8)洗净 ,分离雌、雄成虫 ,研磨呈匀浆 ,超声粉碎、低温高速离心 ,取上清 (含 PO)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) ,分别在两侧切取胶宽约 1cm进行酶染色 ,然后用解剖刀准确切下相应的未染色的凝胶。经真空冷冻干燥机冻干后碾成粉末 ,高速电动匀浆成浆糊状 ,冷浸过夜 ,高速离心得上清即为日本血吸虫酚氧化酶粗蛋白 ,进行 SDS- PAGE。利用 SDS- PAGE与 PAGE(点加 1孔预染 Mark蛋白 )的结果 ,对照分析酚氧化酶蛋白的可能分子量及其亚基组成。结果 PAGE:日本血吸虫雌虫、雄虫酚氧化酶蛋白均表现为迁移率相同的 1条主带 ,其对应分子量大约为 81k D。SDS-PAGE:酚氧化酶粗蛋白共出现 5条带 ,分别为 81、6 4、5 4、4 1k D和 2 7k D。结论 初步分析日本血吸虫雌、雄成虫酚氧化酶天然蛋白分子的分子量及其亚基组成基本相同 ,可能为单体酶 (分子量 81k D)或由 3个 2 7k D相同亚基构成的同聚体。

亚精胺对日本血吸虫成虫培养细胞SDH的影响

目的以琥珀酸脱氢酶(SDH)为指标,探讨亚精胺(Spermidine ,Spd)对日本血吸虫成虫培养细胞生长代谢的影响。方法将24 d龄的日本血吸虫成虫用冷消化法制成细胞悬液,联合法将细胞接种于小盖玻片上培养。培养至第4 d ,一部分细胞用含Spd终浓度分别为0(对照)、25、50、75、80、90、100、150、200μmol/L的无血清培养基处理24 h,另一部分细胞用终浓度为75μmol/L的Spd分别处理0(对照)、12、24、36、48、60、72 h。然后用PBS清洗3次,再换用常规培养基继续培养。至第8 d ,对处理过的培养细胞进行SDH细胞化学染色,Olympus-BH2显微镜下观察、拍照,并将结果输入HPIAS-2000图像分析仪进行图像分析。结果用Spd作用24 h,日本血吸虫培养细胞的SDH活性随Spd浓度的升高逐渐增强,75μmol/L时达到最高,>75μmol/L,SDH活性逐渐减弱。当Spd作用浓度为75μmol/L时,日本血吸虫培养细胞的SDH活性随着Spd作用时间的延长逐渐增强,48 h时达到最高,然后逐渐减弱。统计学分析显示,Spd处理后的实验组培养细胞,其SDH活性与对照组细胞比较差异具有显著性(P<0 .05) ;用终浓度为75μmol/L的Spd处理培养细胞48 h,培养细胞的SDH活性显著强于其余各组(P<0 .01)。结论Spd可显著增强日本血吸虫培养细胞的生长代谢活性;用终浓度为75μmol/L的Spd处理48 h,培养细胞的SDH活性最强。

MNNG诱导对日本血吸虫成虫培养细胞核仁组织区相关嗜银蛋白的影响

目的观察甲基硝基亚硝基胍（MNNG）诱导后日本血吸虫成虫培养细胞核仁组织区相关嗜银蛋白（Ag—NORs）含量的动态变化，探讨MNNG诱导后培养细胞的增殖能力。方法将日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上，置于含20％小牛血清附加常量抗生素的RPMI-1640常规培养基中培养；培养第4天，细胞随机分为实验组和对照组两组，实验组细胞以含3g／ml MNNG的常规培养基处理48h，对照组细胞则用不含MNNG的常规培养基作相同处理。细胞经彻底清洗后继续以常规培养基培养3周，然后换用含5％小牛血清的低血清培养基培养。MNNG处理后第1—9周，每周取实验组和对照组细胞采用略作修改的胶银法进行Ag—NORs染色，光镜下观察与拍照，HPIAS-2000图像分析仪测定代表培养细胞内Ag—NORs含量的吸光度（A）值，并进行统计学分析。结果培养过程中，对照组细胞着色逐渐变浅，MNNG组细胞除在第2周时着色变浅外，其余均逐渐加深，尤其在第6周（MNNG诱导后第5周），细胞核呈深棕色，可见粗大的银染颗粒，核仁呈黑色，并观察到分裂细胞。第7—9周，两组细胞着色均逐渐变浅。定量分析发现，对照组细胞在培养初期Ag—NORs含量最高，随后逐渐降低；MNNG组的Ag—NORs含量在培养第2周时稍有降低，随后逐渐升高；在培养第6周即MNNG诱导后第5周时达到高峰，然后又逐渐下降。结论MNNG诱导可显著增强培养细胞的rDNA转录活性，提高细胞的分裂增殖能力，在MNNG诱导后第5周细胞增殖能力最强。