人膀胱癌相关蛋白基因及其编码蛋白质的结构及功能预测

目的 :预测人宫颈癌候选抑癌基因———膀胱癌相关蛋白 (BLCAP)基因及其编码蛋白质的结构及功能。方法 :将克隆有全长BLCAP基因的 pLXSN BLCAP质粒测序后 ,采用生物信息学的方法对其在核酸及氨基酸水平上进行分析 ,并对其编码的蛋白质的功能做了初步预测。结果 :发现了几条与BLCAP基因同源性较高的基因 :Ho mosapiensmRNA(DKFZp5 6 4M0 5 3) ,BC 1 0基因等 ,它们与BLCAP基因的序列相似性分别为 :99%和 87% ,而且不同种属间BLCAP基因较为保守。BLCAP基因编码的 87个氨基酸中亮氨酸 (1 9.5 % )、脯氨酸 (9.1 9% )、丝氨酸 (8.0 4 % )、半胱氨酸 (8.0 4 % )含量较高 ,对其二级结构的分析发现BLCAP基因编码蛋白N端以螺旋结构为主 ,C端以折叠结构为主 ,亲水性较高 ,而中间区域则以无规则卷曲为主 ,疏水性较高。在其 4 5aa～ 6 5aa处存在一个跨膜区 ,在 5 9aa～ 6 6aa处可能存在一个裂解位点 ,在 6 8位的Tyr,73位和 78位的Ser存在着 3个可能的磷酸化位点 ,且在78aa～ 81aa处发现一个典型的 [ST] X(2 ) [DE]结构 ,即酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。结论 :初步预测BLCAP基因为一个调节细胞生长的看家基因 ,其编码的蛋白质为一个Ⅰ型跨膜蛋白 。

宫颈癌高发人群BLCAP基因单核苷酸多态性检测

目的:检测人膀胱癌相关蛋白(BLCAP)基因编码区及调控区的单核苷酸多态性(SNPs),并初步探讨其可能对人BLCAP基因功能的影响以及与宫颈癌发病易感性的关系。方法:采用病例对照研究、直接测序及动态等位基因杂交(DASH)技术检测该基因的7个SNP位点其中包括调控区5个、编码区2个,以确定人群中BLCAP基因SNP的类型。结果:位于BLCAP基因下游调控区的SNPrs3795147位点基因型频率和等位基因频率在癌症组和正常对照组间差异有显著性,其中基因型AA和AC的相对危险度分别为33.333和3.761。结论:BLCAP基因可能与宫颈癌发生的易感性密切相关。

宫颈癌相关新基因的筛选、克隆及鉴定

目的:筛选、克隆及鉴定宫颈癌相关基因———BLCAP。方法:利用基因芯片技术对1例原发性宫颈癌患者的癌组织及其癌旁正常组织进行分析;将在宫颈癌组织中表达显著降低的BLCAP基因克隆到pET-28(a)表达载体上,以构建原核表达重组质粒pET-28(a)-BLCAP,通过PCR、限制性内切酶酶切和DNA测序等技术鉴定阳性重组子。结果:通过基因芯片分析发现存在表达差异的原癌和抑癌基因共11条,其中表达降低最明显的是BLCAP基因。构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,即BLCAP基因共264 bp,基因序列无改变,基因插入后阅读框(ORF)正确。结论:筛选出了在宫颈癌中表达显著降低的BLCAP基因并成功构建了pET-28(a)-BLCAP原核表达质粒,为表达BLCAP目的蛋白及研究该蛋白的性质奠定了基础。

采用反复照射方法建立放射抗拒性鼻咽癌细胞系亚株

目的为成功建立放射抗拒性鼻咽癌细胞系亚株,并探讨鼻咽癌放射抗拒机理。方法采用类似临床放疗的照射模式反复照射从人鼻咽癌细胞系CNE-3中分离出具有放射抗拒性的新细胞系亚株。结果采用类似临床放疗的照射模式反复照射分离出具有放射抗拒性的新细胞系亚株CNE-3R,,其在传代3个月后仍表现出较稳定的放射抗拒性,其SF2值均>0.5。结论采用该研究方法能成功建立放射抗拒性鼻咽癌细胞系亚株,为研究鼻咽癌放射抗拒机理提供了必要的工具。

人乳头瘤病毒16型变异株E7蛋白在HeLa细胞中的表达及亚细胞定位

目的构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)-人乳头瘤病毒16型变异株E7(HPV16-HBE7)重组质粒pEGFP-HBE7,研究HPV16-HBE7蛋白亚细胞定位,为进一步了解其生物学功能奠定基础。方法采用分子克隆技术,将HPV16-HBE7基因克隆在pEGFP-C1表达载体上,用脂质体法导入宫颈癌细胞中;West-ern印迹检测HBE7蛋白的表达;同时借助免疫荧光技术和EGFP-融合蛋白技术,采用激光共聚焦显微镜观察HBE7蛋白的亚细胞定位。结果重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定,其目的片段大小、插入位点和核苷酸序列完全正确;结果表明,转染细胞HBE7蛋白的相对表达量其胞浆明显多于胞核;各个时间段HBE7蛋白均以胞浆分布为主,绿色荧光密集点状分布于细胞浆内,而野生株E7(WE7)蛋白分布在核内。结论人乳头瘤病毒16型变异株E7蛋白主要分布在细胞浆内,以胞浆为主的分布可能和HBE7基因发生突变后丢失核定位信号有关。

宫颈癌相关BLCAP基因的原核表达及条件优化

目的利用大肠埃希菌表达系统表达宫颈癌相关BLCAP基因,并优化表达条件。方法利用PCR技术从逆转录病毒重组载体pL(BLCAP)SN中扩增宫颈癌相关BLCAP基因,将其插入到原核表达载体pET-32(a)中,从而构建原核表达重组质粒pET-32(a)-BLCAP,随后将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,所表达的带有His标签目的融合蛋白经Ni2+亲和层析纯化回收,并采用SDS-PAGE和Western印迹对目的蛋白进行分析和鉴定。结果构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,含有重组质粒的表达宿主菌经过IPTG诱导表达了分子量约为28ku的融合蛋白,并经优化确定了最佳的诱导表达条件。结论成功构建了pET-32(a)-BLCAP原核表达质粒,表达并经纯化得到了BLCAP目的蛋白,为研究该蛋白的性质及其制备针对该蛋白的抗体奠定了基础。