菘蓝的4种单体成分抗柯萨奇病毒作用的研究

目的 :了解菘蓝 4种有效单体 (6 ,7,8,9号 )抗柯萨奇病毒B组 3型 (CVB3 )的活性。方法 :通过观察细胞病变效应 (CPE) ,噻唑蓝 (MTT)比色法检测细胞活性 ,用半定量RT PCR检测不同药物浓度下病毒核酸含量 ,以确定有效单体抗CVB3 的作用。结果 :菘蓝的 4种单体成分对CVB3 生物合成均有抑制作用 ,且强于阳性对照药物病毒唑。表现在随着药物浓度的增加 ,CPE程度逐渐减弱 ,病毒核酸的含量逐渐下降。结论 :菘蓝的 4种单体能在体外通过抑制生物合成发挥抗CVB3 作用。

琼脂糖蛋白质A反向免疫共沉淀法纯化蓝舌病毒HbC_3

用高效液相色谱(HPLC)、透射电镜检测琼脂糖蛋白质A反向免疫共沉淀法纯化蓝舌病毒湖北株(BTV HbC3)的效果,组织培养半数感染量(TCID50)比较其纯化前后的生物学活性.结果显示,纯化过程对病毒生物学活性无明显影响,透射电镜下,纯化病毒背景清晰, HPLC解析出纯化物仅单一病毒峰.本纯化体系用于提纯BTV HbC3 效果显著,操作简便,具备高通量高活性纯化病毒的潜能,为建立大量纯制高活性蓝舌病毒用于实验室靶向性抗癌研究和生产实践奠定技术平台.

腺相关病毒介导的人血管内皮生长因子体外转染兔骨髓内皮祖细胞

目的:探讨腺相关病毒-2(AAV-2)介导人血管内皮生长因子-165(hVEGF165)转染兔骨髓内皮祖细胞(EPCs)及其对EPCs增殖能力的影响。方法:构建携带hVEGF165基因的重组腺相关病毒(rAAV)载体pAAV-hVEGF165;制备携带hVEGF165基因的rAAV(rAAV-2-hVEGF165)和携带β-半乳糖苷酶(-βgal)基因的rAAV(rAAV-2-LacZ);体外培养和鉴定兔骨髓EPCs;分别用rAAV-2-hVEGF165和rAAV-2-LacZ体外转染EPCs(AAV/VEGF-EPC和AAV/LacZ-EPC);用RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术等法检测hVEGF165和-βgal的表达,MTT法检测AAV/VEGF-EPC的增殖能力。结果:经酶切鉴定和DNA测序,得到了序列正确的重组质粒pAAV-hVEGF165;AAV/VEGF-EPC能够表达hVEGF165蛋白,AAV/LacZ-EPC能够表达-βgal;rAAV-2-hVEGF165对于EPCs的转染率为64.4%;AAV/VEGF-EPC的增殖能力明显强于AAV/LacZ-EPC和EPCs。结论:EPCs可以被rAAV-2-hVEGF165高效转染,其增殖能力明显增强。本文为进一步探讨AAV/VEGF-EPC用于缺血性血管疾病治疗的可能性奠定了基础。

人肝癌细胞感染蓝舌病毒HbC_3株超微结构的动态观察

目的 探讨蓝舌病毒靶向抗肿瘤的细胞生物学机制。方法 利用透射电镜观察蓝舌病毒HbC3株感染人肝癌细胞Hety-3B的形态发生学以及该病毒引起的细胞的病理改变。结果 BTV-HbC3以受体介导的胞饮作用穿入细胞，溶酶体水解病毒外衣壳，使之成为亚病毒粒子，胞浆内有病毒包涵体及未装配成熟的亚病毒颗粒。随后亚病毒颗粒装配上外层蛋白结构，形成成熟的病毒粒子。病毒感染细胞12～18h时，细胞以挤出的方式释放病毒并达到高峰。18-48h时，病毒进入超感染期，大量细胞发生病变，出现细胞凋亡和溶解。结论 一旦蓝舌病毒感染Hep-3B肿瘤细胞即可在细胞内增殖并诱导该肿瘤细胞进入凋亡，死亡的肿瘤细胞释放出的病毒粒子并再次感染其他肿瘤细胞，直至将全部肿瘤细胞杀灭，其溶瘤方式为链式反应。

线粒体在蓝舌病毒HbC_3株诱导人肝癌细胞凋亡中的作用

目的:探讨BTV-HbC3对人肝癌Hep-3B细胞线粒体功能和膜电位的影响及其与细胞凋亡关系。方法:利用透射电镜和荧光显微镜观察Hep-3B细胞感染BTV-HbC3在24,36,48 h的凋亡情况与其线粒体形态变化;噻唑蓝(MTT)法检测其线粒体功能;流式细胞仪检测经Rh123/PI染色的BTV-HbC3诱导该细胞线粒体跨膜电位(△Ψm)和Annexin V/PI染色的细胞凋亡率。结果:Hep-3B细胞感染病毒在24,36,48 h时可导致线粒体功能下降,同时使线粒体膜电位显著降低,细胞凋亡率显著增加。结论:BTV-HbC3通过诱导凋亡来抑制人肝癌细胞的生长,其机制与线粒体跨膜电位下降有关。

腺相关病毒rAAV-LacZ转导体外培养的骨髓内皮祖细胞

目的:研究表达β-半乳糖苷酶的重组腺相关病毒(rAAV-LacZ)对于体外培养的骨髓内皮祖细胞(EPCs)的转导效率.方法:将pAAV-LacZ、pAAV-helper、pAAV-RC用磷酸钙法共转染HEK293细胞,得到rAAV-LacZ;用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提法浓缩纯化病毒;用AVSachTM ELISA法rAAV2颗粒滴度测定试剂盒测定rAAV-LacZ的滴度;用不同MOI值(1.0×104 ～1.0×106v·g/cell)的病毒感染EPCs,48 h后,用β-Gal ELISA试剂盒测定β-半乳糖苷酶的表达,原位β-gal染色试剂盒染色,根据蓝染的阳性细胞占细胞总数的比率来估计rAAV-LacZ对于EPCs的转导效率.结果:rAAV-LacZ的滴度为9.6×1012v·g·ml-1;rAAV-LacZ对于EPCs的转导率约为60%,当MOI增加到106v·g/cell时,β-Gal的表达量增至(31.40±2.51)ng·mg· protein-1.结论:rAAV-LacZ能够有效的转导EPCs,这为AAV载体应用于细胞生长因子与EPCs联合治疗缺血性血管疾病提供实验基础.

蓝舌病毒HbC_3株诱导人肝癌细胞Hep-3B的凋亡

采用MTT法检测BTV-HbC3对Hep-3B细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测BTV-HbC3诱导Hep-3B细胞的凋亡情况,透射电镜观察感染BTV-HbC3的Hep-3B细胞超微结构变化。结果表明BTV-HbC3对Hep-3B细胞具有抑制效应,并呈浓度和时间依赖性;BTV-HbC3作用下Hep-3B细胞呈现凋亡特征;BTV-HbC3能有效感染人肝癌细胞株Hep-3B,并在其中有限地复制,同时抑制该细胞增殖,诱导其进入凋亡。本研究证实了蓝舌病毒HbC3株对人肝癌细胞Hep-3B的杀伤及其诱导凋亡作用,结合本室已反复证实该病毒不感染人源正常细胞的事实,提示了该病毒具有抗人肝癌之潜能。

Toll样受体7小分子激动剂偶联流感病毒灭活疫苗的研究

目的研究Toll样受体7小分子激动剂SZU-101(T7)偶联H1N1流感病毒灭活疫苗对小鼠的免疫原性及安全性评价。方法将SZU-101与流感疫苗共价偶联形成SZU-101偶联流感疫苗(Flu-T7);体外评价Flu-T7的对脾脏淋巴细胞免疫诱导活性;体内评价Flu-T7对特异性抗体的诱导效果及特性,将BALB/c小鼠随机分为4组,每组8只,分别为生理盐水组、T7组、单独疫苗(Flu)组、Flu-T7组,采用腹腔注射免疫小鼠,3次免疫后检测血清中Flu特异性Ig G及其分型,并考察每组小鼠的生长状况。结果体外实验显示Flu-T7组比Flu组刺激产生更多的IL-12、IFN-γ、TNF-α和IL-6细胞因子(P<0.05),体内实验显示Flu-T7诱导的Flu特异性Ig G的血清抗体效价显著增高,同时利用Ig G2a/Ig G1的比例表明Flu-T7促进小鼠特异性Th1型免疫反应。各组小鼠脾脏指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Flu-T7具有良好的有效性及安全性,有望成为新型高效的流感灭活疫苗。

蓝舌病毒HbC_3株对小鼠乳腺癌MA-782细胞的感染特性

体外研究蓝舌病毒湖北株3(BTV-HbC3)对鼠乳腺癌细胞MA782的感染性并探讨BTV-HbC3靶向性溶癌的机制。观察MA782细胞感染BTV-HbC3的病变效应(CPE);MTT法研究病毒致细胞病变率的特征;透射电镜观察感染病毒后细胞超微结构的变化;免疫组化研究病毒蛋白在细胞内的表达特点;凋亡染色(TUNEL法)观察病毒诱导细胞凋亡的情况;流式细胞仪测定病毒对MA782细胞周期的影响。结果证明BTV-HbC3感染MA782细胞后有明显的细胞病变效应;病毒蛋白主要表达在细胞的胞膜及胞浆内;凋亡染色发现大量的凋亡细胞;流式细胞仪可见明显的亚二倍体峰。故认为BTV-HbC3在体外能有效的感染MA782细胞,并能诱导MA782细胞凋亡。

一种从血清标本中快速提取HBV DNA方法的建立

目的:建立一种快速提取血清标本中HBVDNA的方法,即裂解液煮沸法。方法:以碱裂解法和经典的苯酚法为对照,比较3种方法提取的HBVDNA纯度和半巢式PCR后的阳性率。结果:用裂解液煮沸法提取的HBVDNA进行半巢式PCR的阳性率最高,与两种对照方法之间的差异有极显著意义(P<0.01)。结论:裂解液煮沸法是一种快速、简单、高效的提取血清中HBVDNA的方法。

男性不育症患者X染色体雄激素受体基因外显子1、3、4状态筛选研究

目的研究雄激素受体（androgen receptor,AR）基因与特发无精症之间的关系。方法运用分子生物学方法分别检测35名无精症患者和20名对照组正常男性雄激素受体基因的3个功能区的DNA片段,结果实验组患者和正常男性AR外显子1中（CAG）n重复数在11~27之间,两组无显著差别,35例无精症患者用PCR扩增出雄激素受体外显子3（exon3）片段35例（100%）和外显子4（exon4）片段34例（97.15%）,20名正常已生育男性扩增出AR外显子3（exon3）片段20例（100%）和外显子4（exon4）片段20例（100%）。结论（CAG）n基因多态性与男性精子生成障碍无相关性,exon4缺失通过影响靶细胞核的类固醇激素-受体结合物数量在精子发生中的作用需进一步探讨。

直接抗病毒药物在丙型肝炎病毒及合并艾滋病病毒感染中的应用进展

在过去几年中,抗丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)治疗药物的研发取得了突破性进展。大量基础和临床研究证实,针对病毒蛋白的直接抗病毒药物(direct-acting antivirals,DAAs)能有效治疗HCV感染,获得高达90%以上的持续病毒应答(sustained viral response,SVR)。然而,由于诸多因素的影响,HCV合并人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染的患者尚未得到有效的抗HCV治疗。在此将重点简述了DAAs的分类、作用机制及其临床试验效果;此外,还介绍了宿主靶向药物(host-targeting agents,HTAs)的研发情况,以及DAAs在HCV合并HIV患者中的临床应用进展。

腺相关病毒介导的血管内皮生长因子基因与内皮祖细胞联合治疗肢体缺血

目的探讨腺相关病毒（AAV）介导的人血管内皮生长因子165（hVEGF165）基因转染的兔骨髓内皮祖细胞（EPCs）自体移植对于移植细胞存活率和缺血肢体血管再生的影响。方法构建、制备携带hVEGF165基因或β-半乳糖苷酶（β-gal）基因的AAV载体AAV-hVEGF165和AAV-LacZ；用AAV-hVEGF165和AAV-LacZ分别转染体外培养的EPCs，得到AAV／VEGF-EPC和AAV／LacZ-EPC，用RT-PCR、免疫细胞化学、流式细胞术检测外源基因的表达。分别用AAV／VEGF-EPC、AAV／LacZ-EPC和PBS自体移植于兔右下肢缺血的肌组织，28d后行双侧肢体血流和免疫组织化学检测。结果AAV／VEGF-EPC和AAV／LacZ-EPC内可检测到外源基因的表达。AAV／VEGF-EPC、AAV／LacZ-EPC和PBS组患／健侧血流比值、毛细血管密度分别为0．73±0．21、0.64±0．13、0．45±0．10；（962±291）、（557±132）、（361±69）／mm^2。AAV／VEGF-EPC和AAV／LacZ-EPC组移植成活的EPCs密度分别为（330±81）／mm^2和（204±55）／mm^2。结论AAV能够高效将外源基因转入EPCs，对其进行基因修饰。自体移植从V-hVEGF165酤转染的EPCs可提高其移植存活率和增强其促进缺血肢体血管再生能力。

蓝舌病毒湖北株致人肝癌Hep-3B细胞和人肺腺癌A549细胞死亡机制的研究

目的探讨蓝舌病毒湖北株(BTV-HbC3)致人肝癌Hep-3B和人肺腺癌A549细胞死亡的方式及其作用机制。方法观察细胞感染BTV-HbC3的病变效应;原位末端标记(TUNEL)法检测细胞感染BTV-HbC3是否出现凋亡;激光打描共聚焦显微镜检测荧光标记的细胞核及内质网变化;萤光照度仪检测病毒诱导细胞caspase-3/7、caspase-8和caspase-9的活性变化。结果BTV-HbC3感染Hep-3B细胞后有明显的病变效应,大量细胞凋亡,细胞核染色质边聚,内质网大量空泡形成,caspase- 3/7活性升高,caspase-8和caspase-9未升高;BTV-HbC3感染A549细胞后有明显病变效应,仅见零星凋亡细胞,内质网有空泡形成,细胞核未见染色质边聚,caspase-3/7和caspase-9活性升高,caspase-8未升高。结论BTV-HbC3主要通过细胞内内质网途径诱导Hep-3B细胞凋亡而发挥其抑瘤作用,而对人肺腺癌的抑瘤作用则是通过诱导A549细胞的非凋亡性程序性死亡来实现的。

L-ficolin对A型H1N1流感病毒感染小鼠的保护作用

目的:探讨L-ficolin分子与A型H1N1流感病毒的相互作用机制。方法:将pcDNA3.1-L-ficolin真核表达质粒以及对照质粒分别肌注小鼠后感染A型H1N1流感病毒,观察感染小鼠的体重变化、肺内病毒血凝滴度,并通过肺指数以及肺组织HE染色判断感染小鼠的肺部病变情况,ELISA检测肺组织IFN-γ和IL-4的水平。结果:A型H1N1流感病毒感染后,与对照组相比,注射了pcDNA3.1-L-ficolin质粒的小鼠体重无明显下降,肺内病毒血凝滴度较低,肺组织病变较轻,并且肺内IFN-γ和IL-4的水平增高。结论:pcDNA3.1-L-ficolin对小鼠抵御A型H1N1流感病毒感染有一定的保护作用,该质粒可作为抗流感病毒的新型候选制剂。

丙型肝炎病毒和肝细胞抗病毒机制相互作用的研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是引起慢性肝炎和肝癌的主要病因之一。HCV感染可刺激靶细胞(肝细胞)产生干扰素和干扰素刺激因子,后者能在HCV感染复制周期的不同阶段抑制病毒。因此,肝细胞自身的天然免疫对识别和阻断HCV感染复制至关重要,是机体抗HCV感染的重要防御机制之一。然而,HCV可通过多种机制逃逸肝细胞的天然免疫反应。本文主要描述肝细胞的抗病毒机制对HCV的识别、抑制以及HCV逃逸和拮抗肝细胞天然免疫机制的研究进展。

同时携带人血管内皮生长因子和血管生成素基因的内皮祖细胞血管再生研究

目的用腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体将人血管内皮生长因子165 （vascular endothelial growth factors,VEGF165）和血管生成素-1（angiopoietin-1,Angl）基因同时转入骨髓源性内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）中,观察外源基因的表达并评价其促血管再生的能力。方法用同时携带人VEGF165和Angl基因的AAV载体AAV2-hAngl/VEGF165转染体外培养的兔骨髓源EPCs,用RT-PCR和细胞免疫化学法检测外源基因的表达。实验用新西兰大白兔24只,制作成右下肢缺血模型,随机分成3组：PBS、EPC和EPC/AV组。造模后第10天,向缺血肌组织中分别注射PBS、EPCs和AAV2-hAngl/VEGF165转染的EPCs,用免疫组织化学法评价其血管再生效应。结果EPCs可高效地被AAV2-hAngl/VEGF165转染而表达Angl和VEGF165。细胞移植4周后,EPC/AV组存活的EPCs密度（283±137）/mm^-2明显高于EPC组（191±88）/mm^-2;EPC/AV组的毛细血管密度（856±212）/mm^-2明显高于EPC组（564±177/mm^-2）和PBS组（308±112）/mm^-2;α-SMA阳性血管密度（6.9±3.0）/mm^-2明显高于PBS组（3.6±1.8）/mm^-2,P〈0.05。结论AAV载体可同时将人VEGF165和Angl基因转入EPCs中,转染后的EPCs具有更强的促血管再生能力。

TNFRSF4和TNFSF4基因多态性与HCV感染关系

目的探讨肿瘤坏死因子受体超家族4(TNFRSF4)rs17568和肿瘤坏死因子超家族4(TNFSF4)rs3850641位点单核苷酸多态性(SNP)与丙型肝炎病毒(HCV)感染的关系,为丙型肝炎的筛查、诊断和预防提供临床依据。方法采用病例对照研究方法抽取2011年10月—2015年5月在江苏省9家医院治疗的肾透析患者、20个自然村的既往有偿献血者和南京市公安局强制戒毒所的静脉吸毒人群共2 960人,将其中1 269例HCV抗体阳性者和1 691名HCV抗体阴性者分别作为病例组和对照组,每人抽取5 mL空腹静脉血,采用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法进行基因分型,并应用单因素和多因素logistic回归模型分析TNFRSF4 rs17568和TNFSF4 rs3850641位点基因多态性与HCV感染的关系。结果病例组TNFRSF4 rs17568 AA、AG和GG型基因型携带者分别占46.69%、43.05%和10.26%,对照组分别占44.87%、44.44%和10.68%;病例组TNFSF4 rs3850641 AA、AG和GG型基因型携带者分别占66.09%、30.53%和3.37%,对照组分别占71.89%、26.01%和2.09%;在调整了性别、年龄、是否谷丙转氨酶(ALT)异常、是否谷草转氨酶(AST)异常和感染途径后,多因素非条件logistic回归分析结果显示,与携带TNFSF4 rs3850641 AA基因型的个体相比,携带TNFSF4 rs3850641 AG/GG基因型的个体更易感染HCV(共显性模型:OR=1.251,95%CI=1.052~1.488,P=0.011;显性模型:OR=1.275,95%CI=1.077~1.509,P=0.005);携带rs3850641 G等位基因的数量越多,HCV的感染风险越大(相加模型:OR=1.251,95%CI=1.078~1.450,P=0.003);未发现TNFRSF4 rs17568位点基因多态性与HCV感染有相关性(均P> 0.05)。结论 TNFSF4 rs3850641基因多态性与HCV感染有关。

结核分枝杆菌H37Rv刺激巨噬细胞后差异表达lncRNA分析及鉴定

分析毒性结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M.tb）H37Rv刺激RAW264.7巨噬细胞的表达谱芯片以及筛选和鉴定M.tb H37Rv感染巨噬细胞RAW264.7后差异表达的lncRNA。首先,分析热灭活的H37Rv刺激RAW264.7细胞24h后lncRNA表达谱芯片,并对差异表达的lncRNA和mRNA进行生物信息分析,然后采用实时定量聚合酶链反应对16条在芯片中差异表达的lncRNA进行细胞水平验证;进一步在H37Rv感染小鼠的脾脏和肺脏中检测差异表达的lncRNA。结果显示,表达谱芯片中4 730条lncRNA的表达水平上调,9 558条lncRNA的表达水平下调。生物信息分析筛选的16条lncRNA,其染色体定位于附近蛋白质编码基因的基因间区或者与外显子区域有重叠,mRNA功能注释显示差异表达的mRNA主要集中于转录调节、磷酸化、凋亡等生化过程以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等抗结核的信号通路中。在H37Rv作用下的细胞水平和动物感染模型的组织中RT-q PCR验证出与芯片结果相同的4条lncRNA,其中上调的有3条,下调的有1条。研究中异常表达的lncRNA可为巨噬细胞在结核分枝杆菌感染中的功能紊乱提供线索,为后续的研究奠定基础,进一步的研究将集中于发掘lncRNA在宿主调控中发挥的功能。

精液源性多肽促HIV感染及相关拮抗物的研究进展

性行为是目前艾滋病病毒(HIV)传播的主要途径,超过80%的新发HIV感染是通过性传播。精液不仅是HIV的载体,而且含有能增强HIV感染的多肽。体外实验证明,精液中的前列腺磷酸酶多肽成分(PAP248-286、PAP85-120)能和精囊蛋白(SEM1、SEM2)的多肽片段形成淀粉样原纤维,显著促进HIV感染。这些精液源性多肽利用其独特的cross-β淀粉样原纤维结构和富含阳离子的表面电荷,在病毒和靶细胞间形成阳离子桥(cationic bridge),促进病毒结合靶细胞,从而增强HIV感染。因此,研究人员目前正在研发多种以精液源性多肽为靶点的药物,用于预防HIV性传播。这些药物包括阴离子聚合物、绿茶提取物(EGCG)、苯并噻唑苯胺(BTA)等。体外实验证明,这些药物能抵消精液源性多肽介导的促HIV感染的作用。文章描述了有关精液源性多肽促进HIV感染的研究,以及相关拮抗物的研发工作。