G-四链体碱基突变可增强丙型肝炎病毒DNA疫苗的免疫原性

目的 探讨丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）核心抗原core基因上的G4-四链体（core G4）RNA结构对机体特异性免疫应答的影响。方法 圆二色谱（circular dichroism,CD）检测寡核苷酸链RNA G4（命名为G4R）和突变体G4M（命名为G4RM,在不改变氨基酸密码子的情况下）的G-四链体空间结构;在不改变密码子的情况下采用PCR定点突变的方法把HCV野生型G4-core（DNA）突变为G4Mcore,然后将G4-core和G4M-core基因构建至真核表达质粒pc DNA3.1上（分别称为p G4和pG4M）,免疫印迹（Western blot）分析core基因上G4结构突变后Core蛋白的表达水平。将p G4及pG4M质粒分别用基因导入仪免疫小鼠,检测免疫后小鼠的细胞免疫以及体液免疫水平。结果 CD结果显示寡核苷酸链RNA G4M相比野生型RNA G4结构发生改变,熔解曲线表明G4RM熔解温度低于野生型RNA G4R。Western blot显示在细胞水平及动物水平,pG4M比p G4的Core蛋白表达水平更高（P〈0.05）。动物免疫实验结果表明pG4M免疫后小鼠总IgG及IFN-γ的释放水平增高（P〈0.05）。其中,pG4M免疫组小鼠的IgG水平是p G4组的1.61倍。酶联免疫斑点（Enzyme-linked immunospot,ELISpot）实验中,pG4M免疫后小鼠脾脏细胞IFN-γ的释放水平是p G4的1.39倍。流式实验显示pG4M免疫后小鼠脾脏CD4＋T细胞中IFN-γ产生水平是p G4的1.79倍。结论 本研究首次报道HCV核心抗原core上G-四链体可能抑制其蛋白翻译和免疫应答,core上G-四链体碱基突变可增强翻译水平,并增强其Th1型的细胞免疫应答。核心抗原G-四链体碱基突变可增强HCV疫苗的免疫原性,为研制增强免疫原性的HCV疫苗提供了一种新的策略。

丙型肝炎病毒感染人肝细胞系对多种唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染人肝癌细胞系Huh7.5.1细胞后与肿瘤相关的唾液酸转移酶家族和半乳糖基转移酶家族的35个糖基转移酶的表达变化。方法利用HCV感染的Huh7.5.1肝细胞模型,采用Western blot检测HCV感染后HCV非结构蛋白NS3的表达,定量即时聚合酶链锁反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测HCV感染后HCV-RNA的表达及HCV感染对Huh7.5.1细胞中35个糖基转移酶mRNA表达水平的影响。凝集素染色实验测定HCV感染对Huh7.5.1细胞中糖苷表达水平的影响。结果在HCV感染后的Huh7.5.1细胞中,发现4个唾液酸转移酶(ST3Gal III、ST6Gal NAC III、ST8Sia III和ST8Sia IV)和5个半乳糖基转移酶(B3GALT 1、B3GALT 2、B3GALT 3、B3GALT 4和B4GALNT 2)的mRNA水平明显升高11~45倍,其中变化最大的是B3GALT 1,上升45倍,其次是ST8Sia III和ST8Sia IV,分别上升37倍和39倍。进一步采用凝集素染色实验验证,发现结合末端唾液酸糖苷Neu5Acα6Gal的接骨木凝集素(elderberry lectin,EBL)在HCV感染后升高1.97倍,结合末端半乳糖苷Galβ1,3Gal NAc的尾穗苋凝集素(amaranthus caudatus agglutinin,ACA)和结合Galβ1,4Gal NAc的鸡冠刺桐凝集素(erythrina cristagalli agglutinin,ECA)分别升高3倍和4.3倍。结论 HCV感染导致人肝细胞中特定唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶及其相应糖苷表达水平呈现明显上升。这些结果对研究HCV感染的治疗靶点和诊断标志物具有一定参考价值。

微滴数字PCR定量检测全血样品中结核分枝杆菌特异CFP10基因

目的 采用微滴数字PCR技术（droplet digital PCR,dd PCR）检测全血中结核分枝杆菌特异性CFP10（10-k Da culture filtrate protein,CFP10）基因的拷贝数含量。方法 收集10例活动性肺结核患者（active tuberculosis,a TB）、10例肺外结核患者（extrapulmonary tuberculosis,EPTB）和5例健康对照者（healthy donars,HDs）全血并提取DNA,优化引物最佳扩增条件并制定重组质粒标准曲线,对样本中CFP10基因的拷贝数含量分别用dd PCR与实时定量PCR（quantitative real-time PCR,q PCR）进行检测和比较。结果 对重组质粒的灵敏度检测显示dd PCR技术明显优于q PCR技术。对样本的检测显示q PCR技术检测a TB、EPTB患者与健康人的全血中CFP10含量之间无统计学意义;但是dd PCR技术检测a TB、EPTB患者与健康人之间有显著统计学意义（P〈0.0001）;dd PCR检测a TB和EPTB患者（共20例）CFP10基因绝对定量的浓度约为3.4~94.0 copies/μL。结论 本研究首次报道采用dd PCR技术能灵敏地用于TB患者全血的诊断。

结核分枝杆菌对巨噬细胞岩藻糖转移酶家族基因表达的影响

目的研究结核分枝杆菌标准株H37Rv(inactivated H37Rv,i H37Rv)刺激巨噬细胞RAW264.7细胞后,对岩藻糖转移酶家族中的10个糖基转移酶表达的影响。方法用热灭活的i H37Rv刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7,用qRT-PCR(quantitative realtime polymerase chain reaction)检测i H37Rv分别刺激RAW264.7细胞0 h、4 h、8 h、12 h后对巨噬细胞中10个岩藻糖基转移酶的mRNA表达水平的影响。凝集素染色和流式细胞术检测岩藻糖转移酶对应的糖苷的表达变化。结果 i H37Rv分别刺激RAW264.7细胞0 h、4 h、8 h、12 h后,岩藻糖转移酶1(FUT1)基因的表达随着刺激时间的延长而逐步下调。凝集素染色和流式细胞术检测显示特异性结合岩藻糖转移酶-FUT1对应糖苷的小扁豆凝集素(lens culinaris agglutinin,LCA)在i H37Rv刺激巨噬细胞12 h后结合巨噬细胞上对应的糖苷的能力下降了4.6%。结论 FUT1糖基转移酶在i H37Rv刺激巨噬细胞后发生下调,其有可能作为结核分枝杆菌感染的诊断分子标志和治疗新靶点。

HCV感染人肝癌Huh7.5.1细胞后差异表达的lncRNA及其对细胞增殖的影响

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是导致人类肝脏疾病的重要病原体。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)参与了许多疾病和生物过程的调控,但是lncRNA在HCV感染中的作用还了解很少。本研究旨在筛选HCV感染人肝癌细胞系Huh7.5.1后差异表达的长链非编码RNA(lncRNA),并研究相关lncRNA对细胞增殖及周期相关基因表达的影响。首先,分析HCV感染Huh7.5.1细胞72h前后lncRNA芯片表达谱;然后采用实时荧光定量PCR(Reverse tanscription-quantitative real time PCR,RT-qPCR)的方法对芯片中差异表达明显的17条lncRNA进行细胞水平验证;进一步采用CCK8以及ki67细胞增殖实验研究差异表达最明显的lncRNA对细胞增殖的影响;最后采用RT-qPCR探讨lncRNA对细胞周期蛋白基因cyclin B1/D1/E1的mRNA表达的影响。lncRNA芯片检测结果与RT-qPCR验证的相符的lncRNA中,发现HCV感染Huh7.5.1细胞后上调和下调最明显的两条lncRNA分别是RP11-288L9.1与ADAM20P1,而沉默RP11-288L9.1能抑制细胞周期蛋白基因cyclin B1/D1/E1的表达水平,并抑制Huh7.5.1细胞增殖。首次发现HCV感染后上调的RP11-288L9.1能促进细胞周期蛋白基因的表达水平和Huh7.5.1细胞增殖,另一种下调的ADAM20P1对细胞增殖影响不大。研究结果为HCV感染及肝癌细胞增殖提供了潜在的诊断标志物和治疗的新型靶点,具有一定的参考价值。