双调蛋白对小鼠急性呼吸窘迫综合征的作用及其机制

目的探讨双调蛋白(Areg)对小鼠急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的保护作用及其相关机制。方法①动物实验:选择6~8周龄雄性C57BL/6小鼠,并按随机数字表法分为3组(n=10):假手术组(Sham组)、ARDS模型组〔气管内滴注脂多糖(LPS)3 mg/kg建立小鼠ARDS模型〕和ARDS+Areg干预组〔LPS制模后1 h腹腔注射重组小鼠Areg(rmAreg)5μg〕。于LPS制模后24 h处死小鼠,苏木素-伊红(HE)染色后光镜下观察肺组织病理学改变并进行肺损伤评分;测定小鼠氧合指数、肺湿/干质量比值;用二喹啉甲酸(BCA)法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中白细胞介素(IL-1β、IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子水平。②细胞实验:获取小鼠肺泡上皮细胞株MLE12细胞,培养后分成3组:空白对照组(Control组)、LPS组(LPS 1 mg/L)和LPS+Areg组(LPS刺激后1 h加入rmAreg 50μg/L)。于LPS刺激后24 h收集细胞及培养液,用流式细胞仪检测MLE12细胞凋亡水平;蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测MLE12细胞磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)活化水平以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达水平。结果①动物实验:与Sham组相比,ARDS模型组小鼠肺组织结构破坏,肺损伤评分明显升高,氧合指数明显降低,肺湿/干质量比值明显增加,BALF中蛋白及炎症因子水平明显升高。与ARDS模型组相比,ARDS+Areg干预组小鼠肺组织结构破坏减少,肺间质充血、水肿及炎症细胞浸润均明显减少,肺损伤评分明显下降(分:0.467±0.031比0.690±0.034),氧合指数明显升高〔mmHg(1 mmHg≈0.133 kPa):380.00±22.36比154.00±20.74〕,肺湿/干质量比值明显下降(5.40±0.26比6.63±0.25),BALF中蛋白及炎症因子水平明显降低〔蛋白(g/L):0.42±0.04比0.86±0.05,IL-1β(ng/L):30.00±2.00比40.00±3.65,IL-6(ng/L):190.00±20.30比581.30±45.76,TNF-α(ng/L):30.00±3.65比77.00±4.16〕,差异均有统计学意义(均P<0.01)。②细胞实验:与Control组比较,LPS组MLE12细胞凋亡数量显著增多,MLE12细胞PI3K磷酸化水平、抗凋亡基因Bcl-2水平及促凋亡基因Bax水平增加。与LPS组比较,给予rmAreg处理后的LPS+Areg组MLE12细胞凋亡数量明显减少〔(17.51±2.12)%比(36.35±2.84)%〕,MLE12细胞表达PI3K/AKT磷酸化水平和Bcl-2表达水平显著增加(p-PI3K/PI3K:2.400±0.200比0.550±0.066,p-AKT/AKT:1.647±0.103比0.573±0.101,Bcl-2/GAPDH:0.773±0.061比0.343±0.071),Bax表达明显受抑制(Bax/GAPDH:0.810±0.095比2.400±0.200),差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论Areg可通过激活PI3K/AKT信号通路抑制肺泡上皮细胞凋亡进而减轻ARDS。