超滤法去除抗乙肝转移因子中病毒工艺的验证

目的对超滤法去除病毒工艺进行验证。方法以猪细小病毒 (PPV)为指示病毒 ,观察用截留相对分子质量 (Mr)为 5 0 0 0的超滤膜在进压 0 .14MPa、回流压 0 .0 7MPa和进压 0 .2MPa、回流压 0 .1MPa条件下去除抗乙肝转移因子原液中病毒的效果 ,并以淋巴细胞提取液为供试品 ,在上述条件下超滤 ,用高效液相色谱法测定滤过液中各组分的Mr,以检查膜的完整性。结果PPV滴度为 6 .4logTCID50 /ml时 ,滤过液中未检测出PPV ,经盲传三代 ,亦未发现特异性细胞病变 ;滤过液中各组分Mr 均小于 10 0 0 0 ,表明超滤膜完整。

重组人普兰林肽原核表达载体的构建及表达

目的构建人普兰林肽基因原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌中大量高效表达。方法将胰淀素25位的丙氨酸、28位的丝氨酸和29位的丝氨酸用脯氨酸代替,选用大肠杆菌偏爱的密码子对天然胰淀素碱基序列进行修饰,通过化学合成的方式合成了普兰林肽基因片段,经Kpn I、Hind III双酶切后插入p ET-39b(+)载体,构建p ET-39b+[Pramlintide]重组质粒,转化BL21(λDE3)菌株,筛选重组子,并经IPTG诱导重组蛋白表达。结果构建的普兰林肽基因插入载体位置正确,且序列测定结果与预期一致;在37℃条件下,经0.1 mmol/L IPTG诱导后3 h,重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要存在于胞质蛋白中。结论成功构建重组人普兰林肽原核表达载体,并诱导其在大肠杆菌得以表达,为进一步工业化制备普兰林肽奠定了基础。

关于企业业财融合的思考

目前的市场经济形势不断变化,企业面对的经济压力和市场竞争日益加剧,甚至导致企业的经济收益下降,对于这种情况,企业应当根据市场环境的变化,积极寻求有效措施进行改进,顺应市场经济体制的改革要求,对企业内部经营管理模式进行改革。业财融合已经成为了当前企业提升自身发展水平的首选方式,将财务管理与业务管理相结合,使得企业内部的部门沟通增加,保证企业制定的决策更加准确全面,同时提高企业的市场竞争力。企业在推进业财融合过程中存在一定的问题,需要对其进行深入分析,采取有效措施进行解决。本文主要针对企业业财融合的重要性、业财融合推动过程中存在的问题以及解决对策进行研究讨论。

VUCA视域下员工职业培养与规划的策略研究

员工职业规划与培养是企业现代管理中的重要内容,是强化企业软实力竞争的重要途径。VUCA是宝洁公司首席运营官Robert借用一项军事术语描述的一项新的商业发展格局,是指不稳定(Volatile)、不确定(Uncertain)、复杂(Complex)、模糊(Ambiguous)。立足VUCA理念视域下,客观地分析了VUCA与员工职业培养的关系和新时期企业员工培养的重要性,有针对性地提出企业员工职业培养与规划的策略,促进企业的发展与进步。

重组人β-神经生长因子在昆虫细胞中的表达、纯化及其生物学活性

目的在昆虫细胞中表达重组人β-神经生长因子(Recombinant humanβnerve growth factor,rhβ-NGF),并对表达产物进行纯化和生物学活性鉴定。方法构建rhβ-NGF杆状病毒表达质粒Bacmid+[rhβ-NGF],利用脂质体cellfectionⅡ将质粒转染至昆虫细胞Sf9中,用转染细胞的上清反复感染Sf9细胞,大量收获含目的蛋白的培养上清,利用离子交换层析和分子筛层析纯化rhβ-NGF,纯化产物经SDS-PAGE和Western blot分析,并通过鸡胚背根神经节培养法检测rhβ-NGF的生物学活性。结果重组表达质粒Bacmid+[rhβ-NGF]经测序证实构建正确;重组病毒感染的Sf9细胞可表达rhβ-NGF;纯化的rhβ-NGF蛋白经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约14 200的单一条带,纯度大于98%,能与兔抗人NGF单克隆抗体特异性结合,并能刺激神经节突起生长,其比活性约为600 000 AU/mg。结论成功在昆虫细胞中表达了有生物学活性的rhβ-NGF,为其大量制备奠定了基础。

鼠源性病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证

目的建立8种鼠源性病毒的实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,Q-PCR)检测方法,并进行验证。方法通过4个实验室验证Q-PCR法的特异性、灵敏度及精密性,同时进行病毒模拟污染试验及盲样检测,并将检测结果进行比对。采用Q-PCR法检测26批SARS-CoV-2疫苗生产用单抗细胞株及15批其他鼠源性制品。结果用于8种鼠源病毒检测的Q-PCR法与同科同属或其他鼠源病毒无交叉反应;除实验室2对鼠痘病毒(又名脱脚病病毒)(ectromelia virus,EctV/Mouse Pox,MPV)检测的灵敏度为2×10^(2)copies/μL外,实验室2对其他7种病毒及其他3个实验室对8种鼠源性病毒的检测灵敏度均为2×10^(1)copies/μL;除实验室3对鼠腺病毒(mouse adenovirus,MAdV)检测拷贝数试验间CV为37.58%外,实验室3对其他7种病毒和其他3个实验室对8种病毒检测的试验内、试验间Ct和拷贝数CV均<25%。病毒模拟污染试验检测灵敏度均符合参数要求;4个实验室盲样检测结果符合率为100%。26批SARS-CoV-2疫苗生产用单抗细胞株及15批其他鼠源性制品8种鼠源病毒检测结果均为阴性。结论鼠源性病毒的Q-PCR法具有良好的特异性、灵敏度及精密性,可用于鼠源性生物制品的检测。

人β-NGF在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定

目的利用大肠杆菌表达系统表达经密码子突变的重组人神经生长因子(rhβ-NGF),并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定。方法利用化学合成法合成经密码子突变后的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因及前导肽基因;构建原核表达载体pET28a(+)+[rhβ-NGF],转化大肠杆菌株BL21(λDE3),获得基因工程菌;利用IPTG诱导rhβ-NGF在基因工程菌中表达并收集菌体;分离纯化包涵体蛋白,经体外复性及肠激酶切割去除前导肽后进一步通过镍柱亲和色谱获得rhβ-NGF;通过PC12细胞存活法检测rhβ-NGF的活性。结果构建的基因工程菌能大量表达包涵体蛋白,体外稀释复性后获得的重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测其纯度大于95%,Western blot检测其为目标蛋白;重组蛋白经肠激酶切割及进一步分离纯化后得到的目的蛋白经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,纯度大于99%;经Western blot鉴定其为rhβ-NGF;生物学活性检测结果显示其比活性约为500 000 u·mg-1。结论通过优化设计密码子,建立重组人神经生长因子大肠杆菌表达系统,并实现其在大肠杆菌中的高水平表达。

基于蛋白质结构预测的胰岛素样生长因子-1的制备及活性分析

为了更经济高效地制备胰岛素样生长因子-1 (insulin-like growth factor-1, IGF-1),本研究采用计算机模拟技术对3种IGF-1融合蛋白进行蛋白质结构预测与分子对接,筛选出酶切最适配的IGF-1融合蛋白表达形式。利用基因工程技术构建并鉴定了IGF-1融合蛋白原核表达载体,并转化大肠杆菌Origami B(DE3)菌株,获得重组子;经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达后,对菌体的破菌上清进行亲和层析、脱盐、凝血酶酶切及酶切产物亲和层析纯化得到目的蛋白;通过3T3细胞增殖法建立活性评价体系并对获得的IGF-1进行活性测定。结果显示,构建的IGF-1融合蛋白原核表达载体序列正确,获得的重组子在25℃、0.05 mmol/L IPTG诱导16 h时融合蛋白为可溶性表达,经初步纯化、凝血酶酶切、再次纯化后可获得纯度大于90%的IGF-1目的蛋白,在建立的活性评价体系下测得制备的IGF-1比活为2.47×10^(5)U/mg,与市售标准品接近。本研究建立了一条用于制备IGF-1的完整工艺路线,为IGF-1药物的研制及工业化生产奠定基础。

氯法拉滨的合成新工艺

目的:开发一条新的氯法拉滨合成工艺路线,避开已有的专利方法,提高收率与质量。方法:以2-脱氧-2-氟-1,3,5-三苯甲酰基-α-D-阿拉伯呋喃糖(2)为起始原料,经过溴代,与2-氯-6-氨基嘌呤偶联,再经过甲醇解得到氯法拉滨。结果:开发出一种新的偶联方法,产品质量可靠、收率稳定,制备得到的氯法拉滨其结构经MS,1HNMR,13CNMR确证。结论:该合成新方法完全避开已有的专利方法,操作简便,适合于工业化生产。