中试生产的结核DNA疫苗免疫效能研究

目的以300L发酵罐中试规模生产的冻干Mtb Ag85A质粒DNA疫苗为基础免疫小鼠,对该疫苗的免疫效能进行研究。方法将4～6周龄的BALB/c小鼠20只通过数字表法随机分为2组,一组免疫MtbAg85A质粒DNA疫苗(结核DNA疫苗免疫组),另一组免疫PBS作为阴性对照(PBS对照组);于免疫前采血,肌内注射免疫3次。在第3次免疫后3周摘眼球处死小鼠,收集血清,进行血清特异性抗体检测和细胞因子(IFN-γ、IL-4)检测;同时对每只小鼠取脾细胞进行特异性γ干扰素(IFN-γ)分泌检测和脾细胞CD4+、CD8+百分率检测。结果 (1)免疫前后免疫组与对照组抗体水平吸光度A值均小于0.2。(2)结核DNA疫苗免疫组血清细胞因子IL-4水平[(146.2±34.3)pg/ml]低于PBS对照组[(177.7±28.1)pg/ml],差异有统计学意义(t=2.244,P=0.038),而IFN-γ水平[(129.6±159.0)pg/ml]虽然高于PBS对照组[(76.5±21.5)pg/ml],但差异无统计学意义(t=-1.047,P=0.309)。(3)酶联免疫斑点检测结果表明结核DNA疫苗免疫组脾细胞特异性IFN-γ分泌水平(分泌IFN-γ细胞个数)(103.60±112.14)高于PBS对照组(5.78±5.83),差异有统计学意义(t=36.538,P=0.018)。(4)结核DNA疫苗免疫组CD4+细胞百分率均值(21.57%)高于PBS对照组(12.17%),差异有统计学意义(t=3.043,P=0.038);CD8+细胞百分率均值(13.70%)与PBS对照组(10.57%)相比,差异无统计学意义(t=0.847,P=0.445)。结论Mtb Ag85A质粒DNA疫苗主要刺激机体Th1型细胞免疫,而对诱导机体产生Th2型细胞免疫应答没有显著的促进作用。

不同剂量结核病DNA疫苗的电转染免疫原性研究

目的 研究不同剂量结核病DNA疫苗电转染后的免疫原性.方法 40只BALB/c小鼠通过随机数字表法分为8组,每组5只.其中4组分别用100 μl生理盐水和10 μg、50 μg、100 μg结核分枝杆菌Ag85A DNA肌内注射免疫小鼠;另4组用100 μl生理盐水和10 μg、50 μg、100 μgAg85ADNA肌内注射加电转染免疫小鼠.每2周免疫1次,共3次.最后1次免疫后2周杀死小鼠.用ELISA方法检测小鼠脾细胞培养上清液中γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（interleukin 4,IL-4）水平;用流式细胞术检测小鼠外周血单个核细胞（PBMC）分泌IFN-γ的辅助性T细胞（helper T cell,Th）1细胞百分比、分泌IL-4的Th2细胞百分比,以及Th1与Th2的细胞比值.用SAS 9.2软件处理数据,实验数据以“-x±s”表示,对有关数据进行两因素析因设计的方差分析,两两比较采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 免疫结束后2周,小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平,50 μg[（646.05±342.53） pg/ml]和100 μgAg85ADNA肌内注射组[（738.61±372.68） pg/ml]显著高于生理盐水组[（1.73±3.88）pg/ml]（f值分别为4.065、4.647,P值均＜0.05）和10 μg Ag85A DNA组[（87.83±120.82）pg/ml]（t值分别为3.513、4.094,P值均＜0.05）;10 μg Ag85A DNA电转染组[（357.06±105.18） pg/ml]显著高于生理盐水组（t=2.247,P＜0.05）,高于100 μg Ag85ADNA电转染组[（86.08±135.73） pg/ml],但差异无统计学意义（t=1.706,P＞0.05）;50 μg Ag85ADNA电转染组[（648.60±439.41）pg/ml]显著高于生理盐水组（t=4.081,P＜0.05）和100 μg Ag85A DNA电转染组（t=3.539,P＜0.05）.与直接肌内注射组IFN-γ水平[（87.83±120.82） pg/ml]比较,10 μg Ag85A DNA电转染组增高3倍[（357.06 pg/ml）/（87.83 pg/ml）]; 50 μg Ag85A DNA肌内注射组[（646.05±342.53） pg/ml]与电转染组[（648.60±439.41）pg/ml]比较,差异无统计学意义（t=-0.016,P＞0.05）;100 μg Ag85A DNA电转染组[（86.08±135.73）pg/ml]较肌内注射组[（738.61±372.68） pg/ml]降低88.35％（t=4.105,P＜0.05）.小鼠PBMC分泌IFN-γ的Th1细胞百分比,不同剂量Ag85A DNA肌内注射组[10 μg Ag85A DNA：（1.39±0.84）％;50 μg Ag85A DNA：（1.55±0.33）％;100 μg Ag85A DNA：（2.13±0.47）％]和DNA电转染组[10 μg Ag85A DNA：（1.42±0.47）％; 50 μg Ag85A DNA：（1.88±0.51）％; 100 μg Ag85ADNA：（1.43±0.68）％]均高于生理盐水组[（0.65±0.31）％]（t值分别为2.002、2.431、4.015、2.084、3.332和2.105,P值均＜0.05）,但不同剂量Ag85A DNA电转染组与肌内注射组之间差异均无统计学意义（t值分别为0.081、0.901和-1.91,P值均＞0.05）.小鼠PBMC分泌IL-4的Th2细胞百分比,不同剂量Ag85A DNA肌内注射组[10 μg Ag85A DNA：（1.42±1.18）％; 50 μg Ag85A DNA：（1.14±0.78）％; 100 μg Ag85A DNA：（1.24±0.76）％]和DNA电转染组[10 μg Ag85A DNA：（1.19±1.09）％; 50 μg Ag85A DNA：（2.06±0.96）％;100 μgAg85A DNA：（1.47±0.65）％]均显著低于生理盐水电转染组[（4.14±2.55）％]（t值分别为-3.392、-3.738、-3.616、-3.676、-2.599和-3.325,P值均＜0.05）,但不同剂量DNA肌内注射组与DNA电转染组之间差异无统计学意义（t值分别为0.284、-1.139和-0.292,P值均＞0.05）.结论 DNA电转染免疫可以增强低剂量DNA疫苗的免疫应答,使用少量的DNA疫苗就可以产生较好的免疫效果.

结核病疫苗研制的免疫优化策略及新疫苗研究进展

目前，预防结核病（tuberculosis，TB）惟一有效的疫苗是卡介苗（bacillus calmette-guerin，BCG），一种活的减毒牛型分枝杆菌（舱bovis）。由于其良好的安全性以及对儿童重症结核病如粟粒性结核和结核性脑膜炎的显著免疫保护效果，WHO坚持建议在新生儿中接种卡介苗。自1928年以来，BCG至今已在182个国家，对40多亿的儿童进行了接种。

全球结核病控制六十年规划的成果、现状和展望

自1990年世界卫生组织发布全球结核病疫情紧急状态的警告以来，已经过去了20多年。通过全世界各国政府和全球各方面机构组织以及科学家们的努力，已经基本遏止了全球结核病的严重疫情，达到了预期的目标。截止2010年，全球结核病患者人数波动在850万～920万之间，平均为880万。

结核DNA疫苗肌肉注射加电转染不同免疫方案免疫效果的研究

目的：研究结核DNA疫苗肌肉注射加电转染不同免疫方案的免疫效果，获得DNA疫苗肌肉注射加电转染免疫的最佳方案。方法40只BALB/c小鼠随机分为4组：（1）生理盐水组。（2）50μgAg85ADNA组。（3）100μgAg85ADNA组。上述3组分别肌肉注射加电转染免疫3次。（4）混合Ag85ADNA免疫组，第1和3次各肌肉注射加电转染10μgAg85ADNA，第2次肌肉注射加电转染100μgAg85ADNA，每2周免疫1次。最后1次免疫后2周、6周每组各杀5只小鼠，用ELISA方法检测小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平；用流式细胞术检测小鼠全血单个核细胞分泌IFN-γ的Th1细胞和分泌IL-4的Th2细胞比值；用定量RT-PCR检测小鼠肌肉电转染部位Ag85ADNA的含量。用ELISA方法检测小鼠免疫前、第1～3次免疫后10d小鼠血清特异性抗体水平。结果免疫结束后2周，小鼠脾淋巴细胞产生IFN-γ水平：混合Ag85ADNA免疫组[（703．66±394．74）pg/ml]和50μgAg85ADNA组[（648．60±439．41）pg/ml]明显高于生理盐水组[（70．58±108．76）pg/ml]（t值分别为3．975、3．629，P值分别为0．0004、0．0010）和100μgAg85ADNA组[（86．08±135．73）pg/ml]（t值分别为3．878、3．532，P值分别为0．0005、0．0013），但混合Ag85ADNA免疫组和50μgAg85ADNA组之间差异无统计学意义（t＝0．3457，P＝0．7318）；全血单个核细胞内Th1/Th2细胞比值：混合Ag85ADNA免疫组（3．82±1．09）均显著高于生理盐水组（0．37±0．11）、50μgAg85ADNA组（1．20±0．80）、100μgAg85ADNA组（1．10±0．60）（t值分别为2．980、2．260、2．352，P值分别为0．0058、0．0315、0．0257）；肌肉注射加电转染部位Ag85ADNA含量：100μgAg85ADNA组[（963．40±892．79）拷贝]显著高于50μgAg85ADNA组[（270．90±398．18）拷贝]和混合Ag85ADNA免疫组[（205．80±136．95）拷贝]（t值分别为2．639、2．887，P值分别为0．0144、0．0081）。免疫结束后6周，小鼠脾淋巴细胞产生IFN-γ水平：混合Ag85ADNA免疫组[（238．43±258．90）pg/ml）]高于生理盐水组[（0±0）pg/ml]、50μgAg85ADNA组[（83．14±135．08）pg/ml]和100μgAg85ADNA组[（163．83±207．13）pg/ml]，但各组之间差异均无统计学意义（t值分别为1．4970、0．9750、0．4684，P值分别为0．1442、0．3369、0．6427）；全血单个核细胞内Th1/Th2细胞比值：混合Ag85ADNA免疫组（4．67±5．05）显著高于生理盐水组（0．77±0．19）、50μgAg85ADNA组（1．23±0．74）和100μgAg85ADNA组（0．51±0．49）（t值分别为3．199、2．971、3．610，P值分别为0．0033、0．0059、0．0011）；肌肉电转染部位Ag85ADNA含量各组之间差异均无统计学意义。第2次免疫后，50μgAg85ADNA组、100μgAg85ADNA组和混合Ag85ADNA免疫组血清抗Ag85A特异性IgG抗体均比第1次免疫后显著升高（F＝7．17，P＝0．0111），但3组之间差异无统计学意义。第3次免疫后，100μgAg85ADNA组和混合Ag85ADNA免疫组血清抗Ag85A特异性IgG抗体比第2次免疫后略有升高，而50μgAg85ADNA组略有降低，但3组之间差异无统计学意义。结论电转染可以使低剂量的DNA疫苗产生较好的免疫效果，低、高剂量混合免疫是DNA疫苗肌肉注射加电转染免疫的最佳方案。