COVID-19疫苗的研究进展

新型冠状病毒肺炎(Coronavirus disease 2019,COVID-19)是由新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的一种新的传染病。阻止COVID-19流行最有效的方法就是研制安全有效的疫苗,目前国内外多家机构开展了COVID-19疫苗的研究,包括核酸疫苗、病毒载体疫苗、灭活疫苗、重组蛋白疫苗、减毒流感病毒载体疫苗等不同类型,并取得了快速进展。本文对COVID-19疫苗的类型、研究进展、存在的问题等进行综述。

柯萨奇病毒A6病毒样颗粒的制备及免疫原性初步研究

手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)是一种常见传染病,以婴幼儿发病为主,柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)是引起HFMD暴发的主要病原体,其疫苗开发有待深入的研究,而病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是潜在安全的候选疫苗。为制备CV-A6 VLPs,并研究其免疫原性,本研究利用Bac-toBac昆虫细胞杆状病毒表达系统共表达P1和3CD蛋白,制备并纯化CV-A6 VLPs,应用间接免疫荧光试验(Indirect immunofluscent assay,IFA)、SDS-PAGE、Western Blot、透射电镜法等方法鉴定。以Al(OH)3为佐剂,三种不同剂量CV-A6 VLPs免疫BALB/c小鼠,采用微量中和试验法检测小鼠血清中和抗体滴度。结果显示,重组有P1和3CD的杆状病毒质粒转染Sf9细胞,可形成CV-A6类病毒颗粒,直径约为26nm。SDS-PAGE和Western Blot结果说明P1前体蛋白被3CD作用切割产生了VP0、VP1和VP3,CV-A6 VLPs由这三个病毒结构蛋白构成。小鼠免疫实验结果显示,CV-A6 VLPs可以刺激产生较高水平抗CV-A6的特异性中和抗体,维持至少12周,并且抗体中和效价与免疫剂量和免疫次数呈正相关。本研究获得重组杆状病毒rBac-CV-A6-P1-3CD,并在Sf9细胞内成功表达CV-A6 VLPs,可以刺激小鼠产生较高水平和持久的体液免疫反应。

柯萨奇病毒A6型VP1和VP2基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建柯萨奇病毒A6型(coxsackie virusA6,CVA6)VP1和VP2基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备抗CVA6VP1和VP2兔抗血清。方法逆转录PCR扩增CVA6VP1和VP2基因片段,整合入表达载体pGEX-6p-1,转化至大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,经过大型SDS-PAGE制备电泳并进行切胶回收纯化,纯化后的融合蛋白GST-VP1和GST-VP2分别免疫家兔,获得兔抗血清。Westernblot(WB)和间接免疫荧光试验(indirectimmunofluorescence assay,IFA)鉴定抗体。结果CVA6VP1和VP2原核表达载体经PCR、双酶切和测序鉴定正确,获得了高纯度的CVA6VP1和VP2融合蛋白,WB和IFA鉴定多克隆抗体制备成功。结论成功构建了CVA6VP1和VP2原核表达载体,获得了重组的CVA6VP1和VP2蛋白及其多克隆抗体。

柯萨奇病毒A6型多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备兔抗柯萨奇病毒A6型(Coxsackie virus A6,CVA6)多克隆抗体,并鉴定其特异性。方法将杆状病毒-昆虫细胞表达系统中共表达的CVA6病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)纯化后免疫日本大耳白兔,制备其多克隆抗体;用CVA6-R69-XY-2016、CVA10-R97-XY-2016、CVA16-V217-XY-2016、EV71-V54-XY-2016及CVA6 Gdula毒株分别感染人恶性胚胎横纹肌瘤RD细胞,体外中和试验及ELISA法检测中和抗体和结合抗体效价,Western blot法及间接免疫荧光试验(indirect immunoinfluscent assay,IFA)检测抗体特异性。结果制备的兔抗CVA6 VLP多克隆抗体与CVA6-R69-XY-2016及CVA6 Gdula毒株的中和抗体效价均可达1024,多克隆抗体仅与这2种病毒的结构蛋白VP1、VP2及VP3产生特异性反应,仅在这2种病毒感染的RD细胞中产生明显的绿色荧光;经ELISA分析,其结合效价达1×10^7。结论成功制备了兔抗CVA6 VLP多克隆抗体,其特异性良好,可为CVA6血清型中和试验鉴别、病毒结构蛋白定性定量分析提供抗体试剂。

柯萨奇病毒A组5型VP1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 原核表达柯萨奇病毒A组5型(coxsackievirus A5,CV-A5)VP1蛋白,并制备抗VP1多克隆抗体(多抗),为CV-A5相关定性定量研究制备试剂。方法 逆转录PCR扩增N端截短的CV-A5VP1-ΔN56后,克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,获得pGEX-6P-1-VP1-ΔN56。将其转化大肠埃希菌BL21(DE3),表达重组蛋白并纯化。用纯化的谷胱甘肽巯基转移酶-VP1-ΔN56融合蛋白经背部皮下免疫日本大耳白兔,制备多抗。结果 重组表达载体构建成功,融合蛋白以不可溶包涵体存在。ELISA、蛋白质印迹法检测表明,获得的兔多抗效价为107,可特异性识别重组和天然CV-A5 VP1蛋白。结论 成功制备重组CV-A5 VP1蛋白及特异性多抗。为中和抗原表征研究及VP1定性定量分析奠定了基础。