以重组肺炎球菌表面黏附素A为载体蛋白的流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的实验研究

目的：研究以肺炎球菌表面黏附素（PsaA）为蛋白载体的 b 型流感嗜血杆菌（Hib）多糖结合疫苗的制备及其免疫原性和免疫保护作用。方法用基因工程技术制备 PsaA 基因重组蛋白（rPsaA），通过酰胺缩合法与 Hib 多糖偶联结合，制成结合疫苗（Hib-PsaA）。用此疫苗免疫接种3周龄幼鼠，同时以破伤风类毒素和 B 型流感嗜血杆菌（Hib）多糖结合疫苗（Hib-TT）接种小鼠作为对照及磷酸盐缓冲液（PBS）接种作空白对照。末次免疫后2周观察小鼠对 Hib 多糖和 PsaA 蛋白的免疫原性应答；同时以肺炎球菌分别注入免疫后小鼠和未免疫的对照小鼠听泡，分别于攻击后第3天和第7天观察小鼠中耳内细菌清除率和中耳炎症反应情况，观察新型疫苗的免疫保护作用。结果以基因工程技术成功制备并纯化 rPsaA 蛋白，并运用酰胺缩合法与 Hib 多糖偶联结合，结合物的洗脱峰前移，证明偶联成功。接种该结合疫苗的小鼠产生的抗 PsaA 的抗体 IgG 几何平均滴度（GMT）为4525；抗 Hib 抗体 IgG 的 GMT 为1393。在接种 Hib-TT 疫苗的对照组中，小鼠产生的抗 Hib 抗体 GMT 为1493，两种疫苗的抗 Hib 抗体 GMT 差异无统计学意义，但是 Hib-PsaA 结合疫苗显示出对肺炎球菌的免疫应答，优于以破伤风类毒素为载体的结合疫苗。细菌攻击后第3天实验组小鼠中耳细菌清除率明显高于对照组，组织病理学检查实验组小鼠细菌攻击后第3天和第7天中耳炎症反应明显轻于对照组，显示了 Hib-PsaA 结合疫苗针对肺炎球菌的有效免疫保护作用。结论运用基因工程技术可获得高纯度、高产量的 rPsaA 蛋白，以酰胺缩合法可成功将 rPsaA 蛋白与 Hib 多糖偶联结合，所制备的多糖蛋白结合疫苗在幼小鼠体内可诱导针对 rPsaA 蛋白与 Hib 多糖的免疫应答反应，并且可有效预防肺炎球菌导致的急性中耳炎。提示该疫苗免疫可以在预防 Hib 感染性疾病的同时，对肺炎链球菌导致的急性中耳炎可能有一定的预防作用。

肺炎球菌PsaA抗原及其在结合疫苗中的应用

目的应用基因工程技术表达和制备肺炎链球菌表面黏附素A（ pneumococcal surfaceadhesin A, PsaA），并与细菌荚膜多糖耦联制备成多糖蛋白结合疫苗，探讨PsaA作为肺炎球菌蛋白载体在增强结合疫苗中其他细菌多糖抗原的免疫原性的同时，还能获得对肺炎球菌的抗体反应，从而达到用一种结合疫苗能诱导出针对两种细菌的抗体免疫应答的目的。方法从肺炎链球菌基因组中扩增psaA基因，将目的基因插入原核表达载体pET-28a，获得重组质粒pET28a-psaA，通过转化进入大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导，采用DEAE．阴离子交换层析法纯化基因重组rPsaA蛋白。将纯化到的rPsaA蛋白与A群脑膜炎荚膜多糖（group A meningococcal polysaccharide, GAMP）耦联成多糖蛋白结合疫苗后，用小鼠动物模型进行免疫实验，检测该疫苗的免疫原性，用ELISA法测定该疫苗在小鼠体内产生的针对肺炎球菌和脑膜炎球菌两种病原菌特异性抗原的抗体水平。结果成功克隆基因重组表达质粒，而且表达的PsaA蛋白在载体上的组氨酸标签之前终止表达，不带有组氨酸标签，保证疫苗的安全性。SDS—PAGE技术分析表明：rPsaA蛋白高效表达，约为菌体蛋白的60％，蛋白质相对分子质量约为37×10’，而且蛋白的可溶性好，不形成包涵体，用DEAE-阴离子交换层析法纯化其纯度可达80％以上。纯化到的PsaA蛋白与荚膜多糖耦联成功，应用于小鼠免疫实验，PsaA蛋白载体能显著增强A群脑膜炎荚膜多糖抗原的免疫原性，并同时产生针对肺炎球菌蛋白抗原和脑膜炎球菌多糖抗原的特异性抗体。结论利用基因工程技术获得无组氨酸标签的PsaA蛋白，并将它与A群脑膜炎荚膜多糖耦联，可以在增强荚膜多糖抗原免疫原性的同时，提高疫苗的免疫保护效果，探讨了给儿童接种一种疫苗能同时预防肺炎和脑膜炎两种传染病的可能性。