PCSK9通过溶酶体稳态-自噬途径调控心肌缺氧再复氧损伤

目的:研究前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)在心肌缺氧再复氧(hypoxia-reoxygenation,H/R)损伤中的作用及机制。方法:C57BL/6乳鼠原代心肌细胞,随机分为4组:空白对照组(Control组)、缺氧/复氧组(H/R组)、阴性腺相关病毒组(H/R+Scramble组)、AAV9-shPCSK9重组腺相关病毒组(H/R+shPCSK9组)。建立H/R模型(缺氧2 h,复氧4 h),使用CCK-8检测各组细胞活力的变化,LDH试剂盒检测细胞损伤程度,白光显微镜观察心肌细胞形态变化,共聚焦显微镜观察细胞内染色质凝集、自噬小体、溶酶体数量和形态等超微结构变化,western blot检测PCSK9、LC3Ⅱ、P62、LAMP2、Cathepsin B等蛋白表达变化。结果:H/R组和H/R+Scramble组较Control组的心肌细胞活力明显降低,LDH水平显著升高,PCSK9、LC3Ⅱ、P62、Cathepsin B蛋白显著升高,而LAMP2蛋白明显降低(P<0.05),这些变化在H/R+shPCSK9组则被逆转。此外,与H/R+Scramble组相比,白光显微镜下H/R+shPCKS9组的部分心肌细胞形态明显较为正常,部分细胞亦有缩短、肿胀以及成团状,但心肌细胞数量仍较多,同时共聚焦显微镜下H/R+shPCKS9组溶酶体数量及比例明显升高,而自噬小体数量虽增加但所占比例显著降低。结论:PCSK9通过破坏溶酶体稳态引起自噬通路受阻,导致自噬小体聚集以及自噬性死亡,进而加剧了心肌缺氧再复氧损伤,而下调PCSK9可通过维持溶酶体稳态,促进自噬通量,从而减轻H/R所导致的心肌细胞损伤。

基于受体交联蛋白激酶3探讨马钱苷对心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用机制

目的基于受体交联蛋白激酶3(RIPK3)探讨马钱苷对心肌细胞缺氧/复氧损伤(H/R)的作用及机制。方法分别使用马钱苷和(或)RIPK3激动剂Necrolr 1预处理H9C2心肌细胞24 h后构建H/R模型,使用CCK-8检测心肌细胞活力,使用ELISA法检测LDH释放水平,使用药物-分子对接分析马钱苷与RIPK3的分子作用,使用Hoechst/PI荧光双染色观察凋亡和程序性坏死比率,使用Calcein AM探针检测线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放程度,使用Western blot检测p-RIPK3、t-RIPK3、p-MLKL、t-MLKL、Cyt-c、cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平。结果一般状态下,马钱苷预处理对心肌细胞无明显毒性用,在H/R处理后发现25μmol/L马钱苷可显著升高细胞活力并降低LDH释放水平。药物-分子对接预测马钱苷与RIPK3具有可靠的结合位点,结合力为-5.68 kcal/mol。马钱苷预处理可降低Hoechst/PI阳性率,抑制mPTP开放,并同时下调p-RIPK3、p-MLKL、Cyt-c、cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3等程序性坏死和细胞凋亡相关蛋白的表达水平,而马钱苷和RIPK3激动剂Necrolr 1共处理则可显著削弱马钱苷对程序性坏死和细胞凋亡的抑制作用。结论马钱苷通过抑制RIPK3的磷酸化活化以同时抑制细胞凋亡和程序性坏死的发生,从而有效减轻心肌细胞H/R损伤。