一种定量PCR试剂盒通过血液诊断HCMV感染效能的Meta分析

目的通过Meta分析,评价达安荧光定量PCR试剂盒通过血液诊断HCMV感染的效能,为HCMV血筛方法的研发提供依据。方法计算机检索中文科技期刊全文数据库、中国期刊全文数据库、万方数字化期刊、Pub Med等数据库,检索通过达安荧光定量PCR试剂盒血液诊断HCMV感染的文献,按照纳入和排除标准筛选文献,提取纳入文献的数据,采用Meta-Disc软件进行Meta分析,检验异质性,根据异质性结果选择相应的效应模型,对纳入文献予以加权定量合并,计算汇总敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比和诊断优势比及其95%CI,绘制汇总受试者工作特征(SROC)曲线,并计算曲线下面积(AUC)。结果共检出相关文献829篇,按照文献纳入标准,最终纳入5篇文献,汇总敏感度为0.94,95%CI(0.89-0.97)、汇总特异度为0.92,95%CI(0.89-0.85)、汇总阳性似然比为11.37,95%CI(7.4-17.46)、汇总阴性似然比为0.07,95%CI(0.04-0.13)、汇总诊断比数比为169.90,95%CI(74.00-390.06),SROC AUC为0.98。结论达安荧光PCR定量试剂盒通过血液诊断HCMV感染具有较高的灵敏度、特异度及稳定性。

武汉市450例无偿献血者中HHV-8病毒的检测及基于ORFK1基因的分型研究

目的:了解武汉市无偿献血人群中人类疱疹病毒8型(human herpes virus 8,HHV-8)的感染情况。方法:对武汉市450例无偿献血者的全血样本分别进行全基因组DNA的提取和血清的采集;采用PCR和ELISA 2种方法进行HHV-8阳性检测,比较2种方法阳性检出率之间的差异性;将检测结果为阳性的PCR样本再进行HHV-8 ORFK1基因的克隆,通过测序分析,同源性比对,进化树构建等对阳性样本进行HHV-8 ORFK1基因分型。结果:PCR和ELISA 2种方法分别检测出25例和23例阳性样本,其阳性率分别为5.56%和5.11%;χ2检验分析表明2种检测方法检出结果无统计学差异(P>0.05)。对23例阳性样本的ORFK1基因的克隆、序列分析结果显示,在23例阳性样本中有15例属于HHV-8 ORFK1基因C亚型,8例属于HHV-8 ORFK1基因A亚型。结论:武汉市无偿献血人群中存在一定比例的HHV-8感染,建议增加对无偿献血者的HHV-8病毒筛选,以保证血源质量。

miR-181a-5p和BACH2表达对白血病CCRF-CEM细胞凋亡和侵袭的影响

目的:探讨微小RNA-181a-5p(miR-181a-5p)靶向BTB与CNC同源基因2 (BACH2)对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞凋亡和侵袭的调控作用,并阐明其作用机制。方法:体外构建BACH2过表达重组质粒(overExpBACH2)、miR-181a-5p inhibitor和inhibitor-NC,转染人ALL T淋巴细胞CCRF-CEM,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法和免疫荧光染色检测转染效果。将CCRF-CEM细胞分为对照组、 inhibitor-NC组、 miR-181a-5pinhibitor组、 BACH2过表达(overExpBACH2)组、 miR-181a-5pinhibitor+空载体(EV)组和miR-181a-5pinhibitor+overExpBACH2组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测G_(2)期细胞百分率和细胞凋亡率。Western blotting法检测各组细胞中细胞周期蛋白D3 (CyclinD3)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (Caspase-3)蛋白表达水平,Transwell小室实验检测各组细胞中侵袭细胞数,RT-qPCR法检测各组细胞中基质金属蛋白酶9 (MMP-9)、基质金属蛋白酶14 (MMP-14)和BACH2 mRNA及miR-181a-5p表达水平。结果:miR-181a-5p inhibitor和overExpBACH2质粒均成功转染CCRF-CEM细胞。与对照组比较,miR-181a-5pinhibitor组、overExpBACH2组、miR-181a-5p inhibitor+EV组和miR-181a-5p inhibitor+overExpBACH2组细胞增殖活性明显降低(P<0.05),G_(2)期细胞百分率和细胞凋亡率明显升高(P<0.05),细胞中CyclinD3蛋白表达水平明显降低(P<0.05),Caspase-3蛋白表达水平和Bax/Bcl-2比值明显升高(P<0.05),侵袭细胞数明显减少(P<0.05),细胞中MMP-9和MMP-14 mRNA及miR-181a-5p表达水平明显降低(P<0.05),BACH2mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。与miR-181a-5p inhibitor组和overExpBACH2组比较,miR-181a-5p inhibitor+overExpBACH2组细胞中上述指标变化趋势更明显。结论:miR-181a-5p可靶向BACH2进而调控ALL细胞侵袭和凋亡,为临床靶向治疗ALL提供了新的靶点。

CTGF在肝纤维化过程中的表达变化及其对大鼠肝星状细胞功能的影响

目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)在肝纤维化过程中的表达变化,并观察其对大鼠肝星状细胞(HSC)功能的影响。方法采用ABC免疫组化法观察肝纤维化动物模型制模后不同时间点的CTGF表达变化;构建CTGF 2个不同基因位点的shRNA重组体质粒并转染HSC,利用实时PCR检测CTGF表达,通过MTT及细胞粘附实验检测细胞功能变化。结果随着肝纤维化进展,CTGF阳性表达呈增强趋势(P<0.05);成功构建表达靶向CTGF的shRNA重组真核表达质粒;MTT实验结果显示干扰质粒组细胞增殖水平[吸光度值为(0.81±0.06)]弱于对照组(1.39±0.07)及阴性质粒组(1.28±0.06),均P<0.05;细胞粘附实验表明干扰质粒组细胞粘附率为(38.1±6.2)%,明显低于对照组的(63.1±3.6)%和阴性质粒组的(62.2±5.0)%,均P<0.05。结论 CTGF参与了肝纤维化的过程,是促进肝纤维化发展的最重要细胞因子之一,且表达水平随肝纤维化进展逐渐升高。CTGF shRNA重组体能明显抑制HSC的增殖和粘附能力。

中国普通人群中HHV-8阳性率Meta分析

目的运用Meta分析中国普通人群中HHV-8(人类疱疹病毒8型)的感染情况,为临床HHV-8检测必要性提供基础数据。方法检索中国知网等数据库,对符合纳入标准的文献运用R3.1.1软件进行Meta分析,计算阳性合并率并发表偏倚评估。结果获得符合纳入标准的文章13篇,共调查12828例,中国普通人群中HHV-8阳性率合并值为9%[95%CI(7%,13%)]。分层分析:男女阳性率分别为9%,9%(P<0.01);≤30,31-40,≥41年龄组阳性率分别为7%,9%,11%(P<0.01)。发表偏倚检测:纳入文献异质性检测(I2=97.3>50%,P<0.1),异质性较高出现偏倚。结论中国普通人群中HHV-8感染率较高,呈现显著的地域分布差异,在输血及器官移植术前检测有潜在风险,需加强对HHV-8检测的重视和干预工作。

利用PMCA技术实验不同剂量MCT联合DTT对PrP^(sc)转化的抑制效应

蛋白质错误折叠循环扩增(protein misfolding cyclic amplification,PMCA)技术,是一种具有感染性的朊蛋白(PrPsc)体外扩增的技术,可用于抑制细胞型朊蛋白(PrPc)向PrPsc转化药物的筛选.本研究在Saborio等提供的方法基础上,成功优化了最佳扩增时间,利用优化的PMCA技术实验了不同剂量氮芥(mechlorethamine,MCT)联合二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)对PrPsc转化的抑制效应.结果发现,MCT联合DTT能体外抑制PrPc向PrPsc的转化,抑制作用具有明显的量效关系.利用针对人PrPc不同结构域的抗体发现,MCT联用DTT可使抗体6H4的抗原表位隐蔽,该表位位于PrPc第1个α螺旋区内,是构象转化的主要部位.对其机制的深入探讨,将有助于新一类可传播性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy,TSE)治疗药物的研发.

复方泛影葡胺在机械性肠梗阻诊治中的应用体会——附415例临床分析

目的探讨复方泛影葡胺在机械性肠梗阻诊疗中的应用效果。方法 2011年6月~2020年6月我院普外科收治的肠梗阻病人415例,根据治疗方法分为两组,对照组207例,采用常规治疗;观察组208例,在常规治疗基础上加用76%泛影葡胺100 ml口服或胃管注入。比较两组肠梗阻完全缓解时间、胃肠减压时间、胃肠减压引流量、总住院时间、中转手术率等指标。结果观察组和对照组肠梗阻完全缓解时间分别为(21.2±8.6)小时和(48.2±6.5)小时,胃肠减压时间分别为(36.2±6.3)小时和(96.2±12.3)小时,胃肠减压引流量分别为(867±123)ml和(1 800±126)ml,总住院时间分别为(6.3±2.3)天和(14.3±3.2)天,中转手术率分别为10.1%和21.7%,两组比较差异有统计学意义(P均<0.05)。结论泛影葡胺在机械性肠梗阻诊疗中的应用安全、方便、经济、有效。

抗凝与非抗凝血液标本对4项传染性指标酶联免疫吸附试验的影响

目的:探讨抗凝与非抗凝血液标本4项传染性指标酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结果是否存在差别。方法:方法:①留取380人份经枸橼酸-枸橼酸钠抗凝的血液标本及非抗凝的血标本各一管,进行平行检测。②本中心2007年8-10月初次ELISA检测0.8≤S/CO≤1的32人份抗凝血样标本,进行抗凝血与非抗凝血标本各一孔ELISA试验复试,观察2孔的复试结果是否一致。③对本中心2007年6-10月的15份重复反应性标本初次检测结果与双孔复试结果进行单因素方差分析。结果:①配对t检验发现380人份标本的平行试验,部分项目结果差异有统计学意义。②32份初次检测0.8≤S/CO≤1的抗凝血标本,经抗凝血与非抗凝血标本各一孔复试后,复试结果一致率达96.88%。③15份重复反应性标本初次检测结果与双孔复试结果单因素方差分析,差异无统计学意义。结论:采用枸橼酸-枸橼酸钠抗凝血标本,对血液4项传染性指标ELISA初次检测结果存在着一定干扰,但经抗凝血与非抗凝血标本各一孔复试后,这种干扰可以消除。

武汉献血人群抗-HCV ELISA检测反应性标本联合Realtime-PCR的研究

目的:对现有的2种国产抗-HCV ELISA试剂检出的反应性标本进行Realtime-PCR扩增,对结果进行分析,比较2种方法的检出率。为制定ELISA检测结果假阳性的献血者献血资格的恢复措施提供依据。方法:对日常工作中的检测标本用2种抗-HCV ELISA两步法试剂做初检,反应性结果再次双孔复试。对任何一种试剂经复试检测后仍为反应性的标本进行Realtime-PCR扩增,对所有检测结果进行分析。结果:共检测无偿献血标本63 169份,其中检出抗-HCV反应性标本206份,对206份标本进行Realtime-PCR扩增,共扩增出91例HCV-RNA阳性标本,53例科华试剂单反应性标本中仅2例HCV-RNA结果为阳性,41例新创试剂单反应性标本中6例HCV-RNA结果为阳性。ELISA试剂检出的标本S/CO值在不同的区间内的,都有HCV-RNA为阳性的标本。结论:ELISA试剂检测出的抗-HCV标本很多可能为假阳性,特别是单侧试剂呈反应性的标本。但即使ELISA检测S/CO值仅在灰区的单试剂反应性标本,仍不能排除为HCV感染者。

2014—2020年我国献血人群HIV检测情况分析

目的分析我国献血人群人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)检测数据。方法收集2014—2020年初次献血者和重复献血者的HIV检测数据,对纳入研究不同地区的16家血液中心的HIV Ag/Ab不合格率和HIV Ag/Ab合格献血者中HIV RNA不合格率及HIV-Ab确证阳性率数据统计分析。结果初次献血者HIV Ag/Ab不合格率平均为220.56/10万(范围:207.25~250.38/10万),其中,HIV确证阳性率平均为30.54/10万(范围:64.36~403.99/10万)。重复献血者HIV Ag/Ab不合格率平均为109.96/10万(范围:92.95~133.20/10万),其中,HIV确证阳性率平均为17.00/10万(范围:30.69~267.84/10万)。在HIV Ag/Ab合格献血者中HIV RNA平均不合格率在0.46~1.02/10万。各地区献血人群中HIV感染差异明显,其中西南地区最高。结论与初次献血者相比,重复献血者是一个HIV感染更低的人群,且HIV感染率有明显的地域差异。HIV RNA检测可以有效检出处于检测窗口期感染的献血者。

日本血吸虫重组抗原rSj26的磁分离酶联免疫分析的建立及其在低感染度血清抗体检测中的应用

目的建立基于重组日本血吸虫抗原Sj26(rSj26)的磁分离酶联免疫分析(rSj26-MEIA),并将其用于检测低感染度的日本血吸虫病患者的血清抗体。方法将重组质粒pET28a-Sj26转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21,用0.6 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物经镍柱亲和层析法纯化后,二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白含量,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)检测分析rSj26。将纯化后的rSj26与磁珠偶联(100μg抗原/mg磁珠),优化反应条件,建立rSj26-MEIA方法。用rSj26-MEIA和ELISA分别检测58份低密度感染的日本血吸虫病患者血清、30份非血吸虫病流行区阴性血清和6份并殖吸虫病患者血清,并比较两者的检测结果。结果纯化后的重组蛋白含量测定结果显示,rSj26浓度为2.5 mg/ml。SDS-PAGE结果显示,rSj26相对分子质量约27 000,主要以可溶性的形式表达。Western blotting结果显示,rSj26可被感染日本血吸虫的兔血清和小鼠血清特异识别。rSj26-MEIA优化反应条件结果显示,采用rSj26-磁珠0.2 mg(含rSj26 10μg)、血清稀释度为1∶100时,阳性血清平均吸光度(A_550值)/阴性血清平均A_550值(P/N)最大,为3.97。rSj26-MEIA和rSj26-ELISA检测低密度感染日本血吸虫病患者血清的结果显示,两者的阳性检出率均为24.14%(14/58),两者P/N分别为3.61和2.56;相关分析结果表明,两者检测的抗体A_550值间存在正相关关系(r=0.658,P<0.01)。rSj26-MEIA和ELISA检测6例并殖吸虫病患者血清和30例非血吸虫病流行区阴性血清,均未出现阳性反应。结论rSj26-MEIA可作为检测低密度感染日本血吸虫血清抗体的一种新技术。

重组结缔组织生长因子shRNA质粒的构建及其对肝星状细胞基因表达的影响

[目的]构建同时干扰大鼠结缔组织生长因子(CTGF)2个不同基因位点的shRNA质粒,并将其转染肝星状细胞(HSC),研究其对CTGF基因表达的影响。[方法]针对大鼠CTGF mRNA靶向序列设计并合成2对DNA模版序列,用PCR的方法将2条CTGF靶向特异性的shRNA分别链接到质粒pGenesil1.2载体的U6启动子和H1启动子。将构建的干扰质粒以阳离子脂质体法转染HSC-T6细胞,应用RT-PCR及Western Blot检测CTGF的表达。[结果]成功构建CTGF shRNA重组质粒;通过RT-PCR和Western Blot分析发现干扰质粒组的CTGF mRNA与蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。[结论]重组CTGF shRNA能有效抑制HSC中CTGF的表达。

转酮酶样基因TKTL1在人类鼻咽癌发生和转移中的作用

目的探讨转酮酶样基因TKTL1在人类鼻咽癌发生和转移中的作用。方法对65例鼻咽癌和9例鼻咽部慢性炎症组织中转酮酶活性进行检测；实时定量PCR检测鼻咽癌和鼻咽部慢性炎症组织中转酮酶基因家族（TKT,TKTL1和TKT12）mRNA表达水平的变化，并分析TKTL1的表达与鼻咽癌发生和转移的关系。结果鼻咽癌组织中转酮酶活性较鼻咽部慢性炎症组织明显增强（t=4．12，P=0．00）；实时定量PCR结果示鼻咽癌和鼻咽部慢性炎症组织中TKT和TKTL2 mRNA的表达水平差异无统计学意义（t=1．28、1．62，P=0．32、0．26）。然而，鼻咽癌组织中TKTL1的表达水平比鼻咽部慢性炎症组织明显上调（t=6．23，P=0．00），且有淋巴结转移的鼻咽癌组织中TKTL1的表达水平较无淋巴结转移者明显增强，差异有统计学意义（t=3．28，P=0．00）。结论转酮酶样基因TKTL1在人类鼻咽癌的发生和转移中可能起重要作用，TKTL1有望成为肿瘤治疗研究的新靶点。

2种试剂红细胞用于血型反定型检测的效果比较

目的:比较商品试剂红细胞和自制试剂红细胞在血型反定型检测中的效果。方法:应用商品试剂红细胞和自制试剂红细胞在梯形微板中进行反定型检测,比较两种试剂红细胞的一次性判读结果的准确率、亚型和不规则抗体的检出率、手工改动现象、灵敏度及抗干扰能力。结果:商品试剂红细胞同自制试剂红细胞相比,前者的一次性判读准确率较高,手工改动现象较少,灵敏度较稳定,在溶血中抗干扰能力较强,而后者的不规则抗体的检出率较高,脂血的抗干扰能力两者接近。结论:商品试剂红细胞用于血型反定型检测的效果略优于自制试剂红细胞,不同的实验室应结合实际情况进行选择。

国产试剂一步法与两步法检测抗-HCV结果比较

目的:比较一步法与两步法抗-HCV ELISA检测试剂的特异性及灵敏度。方法:分别采用两个不同厂家的一步法及两步法ELISA试剂,对本中心标本进行试验,对比分析两种试剂的血液报废率及检测结果。结果:使用两步法ELISA检测试剂后,血液报废率相对于一步法检测试剂略有下降,可疑阳性标本数明显下降。但灰区和可疑弱阳性标本数两个厂家间有较大差异。不同的两步法检测试剂符合率仍有待提高。结论:两步法抗-HCV ELISA检测试剂优于一步法,但特异性及灵敏度仍有待加强。

维生素D_(3)通过抑制血小板活化影响裸鼠乳腺癌移植瘤的生长

目的:观察维生素D_(3)对裸鼠乳腺癌移植瘤生长的影响,并探讨其对荷瘤小鼠血小板活化的影响。方法:将18只BALB/c裸鼠随机分为正常组、模型组和维生素D_(3)治疗组,每组6个小鼠;模型组和维生素D_(3)组小鼠首先通过皮下注射乳腺癌4T1细胞建立移植瘤模型。10d后维生素D_(3)治疗组小鼠开始腹腔注射维生素D_(3)(0.05μg/d)连续干预10d;测量肿瘤长、短径并绘制肿瘤生长曲线。收集裸鼠外周血及肿瘤组织,采用HE染色观察肿瘤组织病理变化。分离外周血血小板,采用FCM法检测血小板活化标志物CD61和CD62p以及晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end product,RAGE)的表达水平,酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法检测外周血中血管性血友病因子(vonwillebrandfactor,v WF)的浓度。结果:在模型组和维生素D_(3)治疗组裸鼠中建立乳腺癌4T1细胞移植瘤模型。与模型组相比,维生素D_(3)治疗组移植瘤的体积明显减少(P<0.05),肿瘤质量明显减轻(P<0.05),肿瘤组织中血管生成减少,出现肿瘤细胞死亡。与正常组相比,模型组小鼠血小板中CD61、CD62p和RAGE阳性表达率以及v WF浓度均明显升高(P均<0.05);与模型组相比,维生素D_(3)治疗组小鼠血小板中CD61、CD62p和RAGE阳性表达率,以及v WF浓度均明显降低(P均<0.05)。结论:维生素D_(3)可抑制裸鼠乳腺癌移植瘤生长,其抗肿瘤作用可能与抑制血小板活化聚集有关。