大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其生物学特性观察

目的:分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞并观察其生物学特性。方法:实验于2004-05/2006-04在武装警察部队医学院细胞生物学实验室进行。在无菌条件下分离大鼠胫骨、股骨,用预冷磷酸盐缓冲液冲出骨髓,经Percoll梯度分离方法获得骨髓单个核细胞,接种含体积分数为0.10胎牛血清的IMDM培养基中。对单个核细胞行贴壁培养后,通过倒置光显微镜和透射电子显微镜进行细胞形态学观察,流式细胞术进行细胞周期分析,细胞计数法测定细胞生长曲线,免疫细胞化学染色显示c-kit表达。结果:①倒置光显微镜下观察采用Percoll(1.073g/mL)分离的骨髓间充质干细胞大小较为均匀,基本上呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积增大,成纤维样细胞逐渐增多。②透射电子显微镜下观察骨髓间充质干细胞的核质比例较大,核仁大而明显,细胞表面有微绒毛,胞浆内可见核糖体和线粒体,其他细胞器较少,表现出未分化细胞的特征。③细胞生长曲线测定表明接种后第4天细胞进入指数增生期,至第7天进入平台期。④流式细胞术证明G2+S期细胞为11.8%。⑤体积较大的多角形细胞为c-kit阳性,体积较小的成纤维样细胞为阴性细胞,阳性颗粒主要分布在细胞膜和细胞质,细胞核未见表达,阳性细胞比率为55.3%。结论:成功地建立了一种分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的方法,获得的细胞生长稳定,增殖活跃,可作为组织工程的种子细胞。

人脐血间充质干细胞培养及其生物学特性的研究

目的建立人脐血间充质干细胞体外分离培养的最佳条件,并观察其生物学特性。方法在无菌条件下抽取人脐血,用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞,接种含10%胎牛血清的IMDM培养基中。对单个核细胞行贴壁培养后,进行细胞形态学观察,细胞生长、细胞周期分析及细胞凋亡检测,免疫细胞化学鉴定。结果采用Percoll(1.073g/ml)分离的脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)大小较为均匀,呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积较大,成纤维样细胞逐渐增多。细胞生长曲线测定表明接种后第5d细胞进入指数增生期,至第9d进入平台期;流式细胞术证明G2+S期细胞为14.8%;免疫细胞化学染色结果表明42.0%细胞为CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。

SCP诱导人肝癌细胞凋亡与bcl-2基因表达的关系

目的 探讨鲨鱼软骨制剂 (SCP)诱导人肝癌细胞系 (SMMC772 1)凋亡的作用机制。方法 以不同浓度SCP加入体外培养的SMMC772 1细胞中 ,用MTT比色法检测细胞存活率 ;Hoechst33342 /PI荧光染色 ,荧光显微镜分析凋亡细胞百分率 ;流式细胞术进行细胞凋亡定量 ;琼脂糖凝胶电泳检测DNA梯状条带 ;免疫细胞化学染色法检测Bcl 2蛋白的表达。结果 SCP明显抑制SMMC772 1细胞生长 ,IC50 值为 1 2 5mg/ml;荧光显微镜下可见 5 0 %以上细胞为凋亡细胞的形态学改变 ;琼脂糖凝胶电泳呈现梯状条带 (DNAladder) ;免疫细胞化学检测显示SCP诱导人肝癌细胞凋亡过程中Bcl 2表达明显降低。结论 SCP诱导SMMC772 1细胞凋亡 ,可能与下调Bcl 2表达有关。

哇巴因对人血管内皮细胞死亡和钠泵α1、β1亚单位表达的影响

目的:研究钠泵抑制剂哇巴因(ouabain)对人血管内皮细胞死亡的影响及其作用机制。方法:以脐静脉内皮细胞系ECV304为靶细胞,应用MTT实验检测哇巴因对细胞生长的作用;采用Hoechst33342/PI双荧光染色、透射电镜和DNA琼脂糖凝胶电泳等分析细胞死亡特征,半定量RT-PCR法检测钠泵α1和β1亚单位mRNA的表达。结果:哇巴因以浓度和作用时间依赖的方式抑制ECV304细胞生长。10μmol/L哇巴因作用24 h,引起细胞坏死;0.1μmol/L哇巴因作用24~48 h,细胞明显脱落,细胞间连接丧失,细胞出现染色质凝集、分布于核膜内缘、DNA裂解等凋亡特征。哇巴因能明显上调ECV304细胞钠泵α1亚单位mRNA的表达,下调β1亚单位mRNA表达,且两者均呈时间依赖性。结论:哇巴因能诱导人血管内皮细胞ECV304死亡,其上调钠泵α1亚单位表达、下调β1亚单位表达,可能与亚单位介导信号传递、降低细胞黏附有关。

9-顺式维甲酸诱导胃癌MGC803细胞周期阻滞和凋亡的作用机制

背景与目的:9-顺式维甲酸(9-cisretinoicacid,9-cisRA)对胃癌的抗癌活性及机制尚不清楚,本研究以MGC803为靶细胞观察9-cisRA对胃癌的作用。方法:采用RT-PCR法检测维甲类X受体α(recinoidXreceptor!,RXRα)、细胞周期蛋白CyclinD1和细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4mRNA表达,流式细胞术检测细胞周期,MTT实验检测9-cisRA作用MGC803细胞后生长抑制情况,Hoechst33342/PI双荧光染色和琼脂糖凝胶电泳检测凋亡,免疫细胞化学检测凋亡相关基因Bcl-2蛋白表达。结果:0.1～10μmol/L9-cisRA作用MGC803细胞96h,能显著抑制细胞增殖。10μmol/L9-cisRA分别作用48、72和96h,G1期细胞随着作用时间的延长而增加,呈明显的G1期阻滞。作用72h后,细胞出现核染色质凝集、DNA片段化等凋亡特征;从作用48h开始,Bcl-2表达即显著下降。在MGC803细胞中RXRα表达较弱,经10μmol/L9-cisRA作用48h其表达水平显著增加(P<0.01);作用96h,细胞中CyclinD1和CDK4表达显著降低(P<0.01)。结论:9-cisRA能明显诱导MGC803细胞周期G1期阻滞和凋亡,该作用可能与其下调细胞周期因子CyclinD1和CDK4表达有关。

鲨鱼软骨抽提物诱导人胃癌细胞凋亡并下调Bcl-2表达

目的 :探讨鲨鱼软骨抽提物 (SCP)诱导人胃癌MGC80 3细胞调亡的作用机制。方法 :以不同浓度SCP加入体外培养的MGC80 3细胞中 ,用MTT比色法检测细胞存活率 ;Hoechst3 3 3 42 /PI荧光染色 ,荧光显微镜分析凋亡细胞百分率 ;流式细胞术进行细胞凋亡定量 ;琼脂糖凝胶电泳检测DNA梯状条带 ;免疫细胞化学染色法检测Bcl 2蛋白的表达。结果 :SCP明显抑制 (MGC80 3细胞生长 ,IC50 值为 1mg/ml;荧光显微镜下可见 60 %以上细胞为凋亡细胞的形态学改变 ;琼脂糖凝胶电泳呈现梯状条带 (DNA 1adder) ;免疫细胞化学检测显示Bcl 2表达明显降低。结论 :SCP诱导人胃癌MGC80 3细胞凋亡 ,其作用机制可能与下调Bcl

PPARγ和RXRα的表达上调增强了对肿瘤细胞生长的抑制作用

目的研究过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPAPγ)和维甲类X受体α(RXRα)在人消化系统肿瘤(胃癌MGC803、结肠癌LOVO、肝癌SMMC7721)细胞中的表达及其对配体作用的反应。方法采用MTT检测细胞生长;半定量RT-PCR法检测PPARγ和RXRαmRNA的表达。结果吡格列酮(PGZ)单独作用及与9-顺式-维甲酸(9-cis-RA)联合作用72 h,对MGC803和SMMC7721产生较强的抑制作用,联合作用组的抑制作用显著强于PGZ单独作用组(P<0.01),但对LOVO的抑制作用不明显。PPARγ和RXRα在MGC803细胞中有较强表达,在SMMC7721和LOVO细胞中表达较弱。PGZ能显著上调MGC803和LOVO细胞中PPARγ的表达,联合作用组PPARγ表达比PGZ单独作用组显著升高(P<0.05);9-cis-RA能显著上调MGC803和LOVO细胞中RXRα的表达,联合作用组RXRα表达与9-cis-RA单独作用组无明显差别。结论在MGC803、LOVO和SMMC7721肿瘤细胞中,MGC803细胞PPARγ和RXRα表达最强,这对配体发挥作用可能是必需的,配体发挥的抑制细胞生长的效应可能与其介导的信号途径有关。

哇巴因信号的传递及其对细胞生长和死亡的影响

哇巴因(ouabain)是能抑制Na+,K+ ATPase活性的强心甾类物质,在Na+,K+ ATPaseα亚单位位于细胞膜外侧有 1个ouabain特异性结合位点,ouabain结合时,活化胞浆中具酪氨酸蛋白激酶活性的Src,形成Na+,K+ ATPase Src复合物,作为一个活化的“二元”受体,介导信号传递。oua bain对细胞生长和死亡起重要调节作用。ouabain介导细胞发生杂合性死亡,即同一细胞兼具细胞肿胀、细胞器溶解等坏死特征和核凝集、DNA裂解、caspase级联反应等凋亡特征,对于细胞死亡的认识具有重要意义。

Na^+-K^+-ATP酶抑制引起的细胞凋亡和杂合性细胞死亡

Na+-K+-ATP酶也称Na+泵或Na+-K+泵,是哺乳类细胞膜进行离子转运的跨膜载体蛋白。其基本作用是维持细胞膜内外Na+-K+电化学梯度的平衡。近来研究表明,Na+-K+-ATP酶在细胞死亡中起重要作用,细胞K+缺失导致凋亡,在某些类型的细胞中,同一细胞兼具细胞肿胀、细胞器溶解等坏死特征和染色质凝集、DNA梯带、caspase级联反应等凋亡特征,呈现一种特殊的细胞死亡形式,即杂合性细胞死亡。

碱性成纤维细胞生长因子和5-氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞分化潜能和细胞增殖的影响

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和5-氮杂胞苷(5-aza)对体外骨髓间充质干细胞(MSCs)细胞增殖与分化潜能的影响。方法:大鼠骨髓中获得MSCs,培养传代,在倒置相差显微镜和透射电镜下观察细胞形态变化;流式细胞仪检测细胞周期改变;MTT法检测bFGF和5-aga对MSCs生长的影响;免疫细胞化学方法检测actin、desmin、myoglobin、NSE、GFAP的表达。结果:有心肌样细胞和神经元样细胞的形态变化;MSCs经5-aza以及5-aza加bFGF联合诱导actin、desmin、myoglobin、NSE和GFAP的表达均较对照组显著增高;而经bFGF诱导后,前4种蛋白表达无明显变化,仅GFAP蛋白表达显著增高。结论:5-aza对MSCs细胞生长有抑制作用,而bFGF有明显促增殖作用。MSCs被5-aza诱导分化成心肌样细胞和神经元样细胞,bFGF可使MSCs分化为GFAP阳性的神经胶质样细胞。

bFGF促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经胶质样细胞转分化

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)在体外诱导为神经源性细胞的可行性,并探讨其作用机制。方法从Wistar大鼠骨髓中获得rMSCs,纯化培养传代后用不同浓度的bFGF诱导,经MTT法检测bFGF对rMSCs生长的影响;用倒置光显微镜、透射电镜、免疫组化和RT-PCR等方法鉴定诱导后细胞行为改变与snail mRNA表达。结果bFGF对rMSCs具有促增殖作用,在倒置光显微镜和透射电镜下可见到有神经胶质样细胞形成,免疫组化证明GFAP的表达较对照组显著增高(P<0.01)。RT-PCR结果表明,诱导组细胞snail mRNA明显表达。结论bFGF促进rMSCs转分化为GFAP阳性的神经胶质样细胞,转录因子Snail可能与转化过程有关。

纤维蛋白凝胶对大鼠胚胎间充质干细胞增殖与成骨分化的影响:不同质量浓度比较

背景:纤维蛋白是一种天然的可生物降解、组织相容性好的高分子材料,其中血纤维蛋白稳定因子ⅩⅢ已经证明有利于未分化间充质干细胞在高度交联的凝胶支架内迁移,并促进其增殖与分化。目的:探讨大鼠胚胎间充质干细胞在不同质量浓度纤维蛋白凝胶内的形态学变化,以及生长增殖和成骨分化情况。方法:无菌条件下取胎鼠四肢,组织块消化法体外分离培养胚胎间充质干细胞。取传至第3代细胞,分别接种于20,10,5g/L纤维蛋白凝胶内,并设立对照组,接种于无凝胶的正常培养基中。用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞在凝胶内的形态学变化,荧光分光光度计测定细胞增殖状态,酶标仪和Von Kossa染色分析细胞碱性磷酸酶活性和钙盐沉积情况。结果与结论:培养7d,在纤维蛋白凝胶内的大鼠胚胎间充质干细胞具有较长突起,且连接成网,而对照组细胞呈纺锤形或立方形。与对照组比较,凝胶组细胞增殖活跃,至培养第14天达峰值,以5g/L凝胶细胞组荧光最强;凝胶组细胞碱性磷酸酶活性从14d开始增强,21d达峰值。培养14d后20g/L凝胶组在凝胶区出现小矿化结节,随后逐渐融合,而对照组无矿化结节出现。证实纤维蛋白凝胶支架能够支持大鼠胚胎间充质干细胞的存活与生长,且可以促进细胞的增殖和分化。5g/L低浓度凝胶有利于细胞形态的发生,20g/L高浓度凝胶有利于细胞的成骨分化。

间充质干细胞分化为心肌样细胞与P120连环蛋白mRNA表达

目的:研究5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导体外骨髓间充质干细胞(marrow measenchymal stem cells,MSCs)向心肌细胞发展的作用及其机制。方法:从Wistar大鼠骨髓中获得MSCs,培养传代后用不同浓度的5-aza诱导,倒置光显微镜和透射电镜观察诱导前后细胞形态变化;流式细胞术检测细胞周期改变;MTT法检测5-aza对MSCs生长的影响;免疫细胞化学法检测肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达;RT-PCR检测P120连环蛋白1A mRNA的表达。结果:5-aza对MSCs有抑制增殖的作用(P<0.05);在光镜和透射电镜下可见有心肌样细胞的形态变化;免疫细胞化学检测结果表明,MSCs的经5-aza诱导14d,肌红蛋白、结蛋白和肌动蛋白的表达均较对照组显著增高(P<0.01);PT-PCR结果表明P120连环蛋白mRNA表达明显,而对照组未见表达。结论:MSCs可在体外被5-aza诱导分化成心肌样细胞,这可能与P120连环蛋白1A mRNA表达有关。

钠泵的信号转导作用

最近发现 ,钠泵作为P型ATPase超家族的成员之一 ,具有与其他一些重要蛋白质相互作用的结构基础 ;实验研究也表明 ,钠泵作为受体 ,与其配体结合后 ,介导了细胞信号的传递 ,并对细胞增殖和死亡产生重要影响。

从噬菌体7肽库中筛选哇巴因特异性结合的短肽

以哇巴因为靶分子,从噬菌体7肽库中筛选与哇巴因特异性结合的短肽。经过3轮淘筛并通过ELISA法鉴定,获得14个阳性克隆,通过对噬菌体ssDNA电泳鉴定和序列分析筛选得到3种短肽:肽A、B和C的筛选一致率分别为64.3%(9/14),28.6%(4/14)和7.14%(1/14)。Genbank中蛋白质同源性分析显示,肽A、B、C均不与钠泵蛋白同源。放射性配基受体结合法检测结果表明,合成的肽A能够与哇巴因结合。哇巴因特异性结合短肽的获得将为阻遏内源性哇巴因与钠泵的结合、防治高血压奠定基础。