N-乙酰半胱氨酸抑制急性创伤性脊髓损伤后细胞凋亡的作用机制

目的 探讨N-乙酰半胱氨酸（NAC）抑制急性创伤性脊髓损伤（SCI）后细胞凋亡的作用机制。方法 选取清洁级成年雄性健康Sprague Dawley大鼠54 只，完全随机分为单纯椎板切除组（Sham组）、急性SCI对照组（SCI组）和NAC组，各18只。Sham组单纯行T9~10椎板切除术；SCI组利用悬线法分离后使用显微剪完全横断脊髓建立大鼠T9~10脊髓损伤的急性SCI模型；NAC组在SCI组基础上于伤后30 min、12 h经腹腔注射150 mg/kg NAC，2次/d，连续7 d。在造模后的第24小时，每组分别取12只断头处死，使用原位末端转移酶标记（TUNEL）染色（6只）观察凋亡细胞,蛋白质免疫印迹实验（6只）观察抗凋亡的B淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2）、促凋亡的Bcl-2相关X蛋白（Bax）的表达情况。每组剩6只继续饲养至第8周。分别于伤后1、2、4、6、8周行大鼠脊髓损伤（BBB）评分和斜坡实验评价神经功能。结果 TUNEL染色结果显示，SCI组和NAC组TUNEL阳性细胞数多于Sham组［（95.0±3.0）、（72.0±2.6）个比（0.0±0.0）个］，差异均有统计学意义（F=2 763.375,P＜0.01）。蛋白质印迹实验结果显示，3组均有Bcl-2和Bax表达。SCI组和NAC组Bcl-2表达相对灰度均低于Sham组［（0.225±0.025）、（0.798±0.042）比（1.000±0.071）］，NAC组Bcl-2表达相对灰度高于SCI组（均P＜0.01）；SCI组和NAC组Bax表达相对灰度高于Sham组［（4.59±0.34）、（3.22±0.23）比（1.00±0.16）］，NAC组Bax表达相对灰度低于SCI组（均P＜0.01）。BBB评分结果显示，在第1、2、4、6、8周，SCI组和NAC组BBB评分均低于Sham组［0（0，0）、1（0，1）分比21（21，21）分，（1.3±0.5）、（2.7±0.8）分比（21.0±0.0）分，（3.5±1.1）、（7.0±1.4）分比（21.0±0.0）分，（5.3±1.8）、（9.3±2.1）分比（21.0±0.0）分，（7.8±1.5）、（12.5±1.4）分比（21.0±0.0）分］，NAC组BBB评分高于SCI组（均P＜0.05）。SCI组和NAC组组内第1、2、4、6、8周BBB评分比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。斜坡实验显示，在第1、2、4、6、8周，SCI组和NAC组斜坡角度均低于Sham组［（16.0±2.6）°、（18.3±2.6）°比（78.3±3.4）°，（18.7±2.6）°、（21.3±3.2）°比（78.0±3.6）°，（22.3±3.3）°、（30.0±4.1）°比（77.7±3.3）°，（27.8±2.9）°、（38.8±2.8）°比（78.8±2.6）°，（30.5±2.9）°、（44.8±3.4）°比（78.5±3.3）°］，在第4、6、8周NAC组斜坡角度高于SCI组（均P＜0.05）。SCI组和NAC组组内第1、2、4、6、8周斜坡角度比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。结论 NAC可能通过降低大鼠脊髓损伤区组织中促凋亡基因Bax的表达及增强抗凋亡基因Bcl-2的表达而发挥神经保护作用。

三维打印胶原蛋白-壳聚糖复合支架中大鼠神经干细胞的生长和分化情况

目的观察三维打印胶原蛋白-壳聚糖复合生物支架中大鼠神经干细胞（NSCs）生长和分化情况。方法取妊娠1d～16d的SD大鼠胚胎大脑皮质，分离培养和鉴定大鼠NSCs。采用低温三维打印联合冷冻干燥技术制备胶原蛋白一壳聚糖复合生物支架，将NSCs移植入三维支架共培养，并将常规悬浮培养NSCs为对照组（3组，每组5个复孔），三维打印胶原蛋白一壳聚糖复合支架共培养的NSCs为观察组（3组，每组5个复孔），使用倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞在支架上的生长状况。分别采用细胞计数试剂盒和免疫荧光法检测NSCs的吸光度值和分化情况。结果NSCs培养第3代神经球中免疫荧光检测提示Nestin蛋白表达阳性，诱导7d后NSCs的免疫荧光检测提示神经元特异性核蛋白（NeuN）和神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达阳性。三维打印胶原蛋白-壳聚糖复合支架为三维多孔立体结构，四边形孔径为（510±63）μm。显微镜及扫描电镜观察结果显示NSCs可在支架中很好地生长、分化。观察组共培养1、4、7、11、14d吸光度值均高于对照组[（0．34±0．04）比（0．21±0．03）、（0．70±0．08）比（0．35±0．04）、（0．92±0．11）比（0．67±0．08）、（0．75±0．09）比（0．42±0．05）、（0．53±0．07）比（0．27±0．03）]，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。三维打印胶原蛋白-壳聚糖复合支架周围和内部存在NeuN和GFAP阳性细胞。结论三维打印技术可制备微观结构可控的胶原蛋白-壳聚糖复合支架，且具有良好的生物相容性，适宜NSCs生长和分化．

胰岛素样生长因子-1对氯化钴诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对氯化钴(CoCl_2)诱导的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡的作用及机制。方法取对数生长期的PC12细胞,分别以10、20、40、80μmol/L的CoCl_2溶液和100、200、400μg/L的IGF-1溶液处理细胞,CCK-8法检测细胞活力,得出CoCl_2和IGF-1最佳干预浓度。根据选定的实验条件,应用CoCl_2处理PC12细胞建立HIE细胞模型,实验分为对照组、CoCl_2处理组、IGF-1+CoCl_2处理组。分组处理24 h后采用CCK-8法检测细胞存活率;TUNEL染色检测细胞凋亡情况;Western blot检测各组细胞Bax、Bcl-2及Caspase-3的蛋白的表达水平。最后在上述实验的基础上,设CoCl_2处理组、CoCl_2+IGF-1处理组、HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇(2-MeOE2)+CoCl_2组和CoCl_2+2-MeOE2+IGF-1组,Western blot观察IGF-1、2-MeOE2及两者共用对PC12细胞HIF-1α及Bax的表达水平的影响。结果 CCK-8检测结果显示,40μmol/L CoCl_2和200μg/L IGF-1为最佳干预浓度。利用以上浓度分组干预细胞24 h后,与CoCl_2组相比,IGF-1+CoCl_2处理组细胞存活率明显提升,TUNEL阳性细胞数和细胞比例降低,同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调,促凋亡蛋白Bax、Caspase-3,HIF-1α表达下调,差异均有统计学意义(均P<0.05)。应用2-MeOE2对细胞进行预处理后,CoCl_2+2-MeOE2组与2-MeOE2+IFG-1组HIF-1α和Bax蛋白表达差异无统计学意义,但均较CoCl_2+IGF-1组明显下调(P<0.01)。结论 IGF-1可抑制CoCl_2诱导的PC12细胞凋亡,其保护作用可能与HIF-1α表达下调有关。

不同局部麻醉药对人脂肪间充质干细胞凋亡及成骨分化的影响

目的 探讨不同局部麻醉药对人脂肪间充质干细胞（ADMSCs）的凋亡及向成骨方向分化的影响.方法 应用差速贴壁法对人ADMSCs原代培养,鉴定第3代ADMSCs表面抗原CD29、CD105表达,并检测其成脂和成心肌分化能力.将第3代ADMSC,细胞分为4组,3实验组分别加入终浓度为200 mg/L的利多卡因、罗哌卡因和布比卡因干预ADMSCs,对照组加入普通DMEM低糖培养基.分别应用PI-Hoechst33342和茜素红染色法检测各组ADMSCs凋亡率和成骨细胞分化率.结果 经不同局麻药干预3、5、7d后,对照组的细胞凋亡率分别为（10.2±3.5）％、（12.4±3.6）％、（16.9±3.9）％,布比卡因组分别为（15.3±2.8）％、（23.6±3.8）％、（27.4±4.6）％,利多卡因组分别为（31.8±4.2）％、（42.4±5.5）％、（61.6±6.9）％,罗哌卡因分别为（34.8±5.9）％、（43.2±6.8）％、（64.9±5.8）％.利多卡因和罗哌卡因组在不同时点的细胞凋亡数量均明显高于对照组（均P＜0.05）,而且也明显高于布比卡因组（均P＜0.05）.结论 利多卡因、罗哌卡因能增加ADMSCs细胞凋亡比例,但布比卡因可抑制ADMSC凋亡.

人脐带间充质干细胞源外泌体对氧糖剥夺复氧静脉内皮细胞凋亡的抑制作用

目的探究人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSC)源外泌体对氧糖剥夺复氧人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)凋亡的抑制作用,阐明其可能的机制。方法培养HUCMSC,将收集的细胞上清液使用超速离心法提取HUCMSC分泌的外泌体(HUCMSC-exosomes,HUCMSC-EXO)并对其进行鉴定,将HUVEC随机分为正常对照组、模型组(氧糖剥夺/复氧组)和分别添加不同浓度的HUCMSC-EXO(20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml)处理组(在模型组的基础上加入HUCMSC-EXO)。倒置相差显微镜形态学观察各组HUVEC细胞的表观变化,使用CCK8试剂测算各组HUVEC增殖抑制率,Western blot检测相关凋亡蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达水平。另设模型组、HUCMSC-EXO+模型组、抑制剂+模型组和HUCMSC-EXO+抑制剂+模型组,Western blot观察HUCMSC-EXO、抑制剂及两者共用对HUVEC细胞HIF-1α及Bax的表达水平的影响。结果成功提取和鉴定HUCMSC-EXO,在倒置相差显微镜下,与正常对照组比较,模型组和不同浓度HUCMSC-EXO处理组的HUVEC体积缩小,变圆,连接疏散,生长状态较差;CCK8检测,HUCMSC-EXO处理组较模型组的细胞活力显著上升,差异有统计学意义(t=9.23,P<0.05),并与剂量呈正相关。Western blot检测,与对照组比较,模型组HUVEC的Caspase-3[(0.296±0.038),(0.879±0.088);t=14.92,P<0.05]、Bax[(0.234±0.034),(0.762±0.084);t=14.36,P<0.05]表达水平上调,Bcl-2的表达水平下调[(0.863±0.103),(0.387±0.059);t=9.85,P<0.05],均差异有统计学意义;与模型组比较,HUCMSC-EXO处理组HUVEC的Caspase-3(0.586±0.075)、Bax(0.311±0.055)水平下调(t=6.24,11.01,均P<0.05),Bcl-2(0.665±0.071)水平上调,均差异有统计学意义(t=7.45,P<0.05)。抑制剂干预实验显示,与HUCMSC-EXO+抑制剂+模型组比较,抑制剂+模型组HIF-1α蛋白[(0.348±0.055),(0.388±0.077);t=1.04,P>0.05]和Bax蛋白[(0.363±0.069),(0.370±0.064);t=0.18,P>0.05]表达差异无统计学意义(均P>0.05),但均较模型组[HIF-1α蛋白(0.919±0.064),Bax蛋白(0.902±0.071)]明显下调,差异有统计学意义(t=13.03,13.56,均P<0.05)。结论HUCMSC-EXO对HUVEC的氧糖剥夺/复氧模型具有保护作用,其机制可能与下调HIF-1α有关。