PBL与开放式实验相结合的免疫学实验教学改革的探讨

因材施教、注重特色教学是近年来教学发展的特点,以学生为主体、教师为辅的PBL教学模式,结合开放式实验的具体实施,既可以充分发挥优秀学生的思维创新性和主动动手能力,又可兼顾能力较差学生,使其能针对自身能力选择适合自己的开放性实验,有利于学生的个性发展。

自分泌IL-6经Ras/MEK/ERK、PI3K/Akt通路促进卵巢癌细胞黏附和侵袭功能的研究

目的探讨内源性IL-6表达改变对卵巢癌细胞黏附和侵袭功能的影响及相关信号转导通路。方法利用以往构建的内源性过表达IL-6的人卵巢癌A2780细胞系和内源性抑制IL-6表达的人卵巢癌SKOV-3细胞,分别采用细胞体外黏附实验、Transwell小室体外侵袭实验、免疫印迹技术等观察IL-6对卵巢癌细胞黏附、侵袭能力的影响,并对其可能的信号通路进行研究。结果与对照组相比,内源性过表达IL-6可促进卵巢癌细胞的体外黏附和侵袭功能;抑制IL-6表达则可抑制卵巢癌细胞的上述功能。过表达或抑制表达IL-6可增加或减少卵巢癌细胞磷酸化ERK、Akt的表达水平,应用ERK或Akt特异性信号阻断剂可显著抑制高表达IL-6的卵巢癌细胞黏附和侵袭作用,提示可能与其活化Ras/MEK/ERK、PI3K/Akt通路有关。结论卵巢癌细胞产生的IL-6可经Ras/MEK/ERK和PI3K/Akt通路增强自身的黏附和侵袭能力,调节IL-6表达及相关信号转导通路可能是未来临床控制卵巢癌进展的一种良好策略。

三维手段定量评估股骨颈骨折复位质量与股骨头坏死的相关性

背景:骨折复位质量对骨折愈合与肢体功能恢复至关重要,传统X射线片与断层CT对量化与直观观察骨折移位效果不佳。Mimics具有快速构建骨骼模型和空间测量的功能,为定量三维空间量化复位质量提供了可能。目的:利用三维测量方法对X射线评估为复位满意的股骨颈骨折患者进行残留移位再测量,并探究残留移位与股骨头坏死的相关性。方法:将2012年1月至2013年12月于武警后勤学院附属医院关节三科接受治疗的141例股骨颈骨折患者纳入研究,按骨折移位程度分组,无移位组44例(Garden1&2),移位组97例(Garden3&4)。利用CT的DICOM数据建立每个患者的三维模型,测量修复术后股骨颈骨折患者的残留移位参数:股骨头中心距离、股骨头小凹距离及空间偏转距离。对患者股骨头坏死情况进行随访,探究残留移位程度与股骨头坏死的相关性。结果与结论:1患者随访时间为25-43个月,无移位组和移位组中分别有7例和21例患者罹患股骨头坏死;2无移位组中股骨头中心距离、股骨头小凹距离、空间偏转角度分别为(7.44±2.84)mm,(11.75±4.12)mm,(17.68±8.99)°;移位组分别为(6.51±3.75)mm,(9.34±5.27)mm,(14.67±7.43)°,两组中除股骨头中心距离外差异均有显著性意义(P<0.05);3提示复位质量欠佳是引起股骨头坏死的重要因素之一;同时X射线在描述空间立体移位和角度中存在不足,在评估股骨颈骨折的复位质量时具有局限性;而利用三维测量手段评估骨折复位质量具有一定的优越性。

IL-6对人卵巢癌细胞体外增殖及锚定非依赖生长能力的影响

目的研究内源性IL-6对卵巢癌(ovarian cancer,OVCA)细胞体外增殖及锚定非依赖生长能力的影响并探讨其作用机制。方法应用前期建立的内源性过表达IL-6的人卵巢癌A2780细胞株和内源性抑制IL-6表达的人卵巢癌SKOV-3细胞株,分别采用MTT法、双层软琼脂集落形成实验、流式细胞术、RT-PCR和Western blot技术检测IL-6对OVCA增殖及锚定非依赖生长能力的影响,并对其作用机制进行研究。结果与对照组细胞相比,过表达IL-6的A2780细胞的增殖及锚定非依赖性生长能力增强(P<0.01),而IL-6抑制表达的SKOV-3细胞则降低(P<0.01)。进一步研究表明IL-6促OVCA细胞增殖作用是通过改变细胞周期分布而非抑制细胞凋亡来实现的;过表达IL-6可显著提高A2780细胞的Cyclin D1、Cyclin B1的表达水平,而抑制IL-6表达则明显降低SKOV-3细胞的Cyclin D1、Cyclin B1的表达水平;应用ERK或Akt特异性信号阻断剂可显著抑制高表达IL-6的A2780细胞增殖及Cyclin D1、Cyclin B1的表达水平。结论 IL-6能促进OVCA细胞的增殖和锚定非依赖性生长,IL-6促OVCA细胞增殖作用是通过增加Cyclin D1、Cyclin B1表达水平从而改变细胞周期分布来实现的,并与活化的PI3K/Akt、Ras/MEK/ERK信号通路有关。

旋毛虫感染对过敏性哮喘模型小鼠干扰素-γ、白细胞介素4及白细胞介素5水平的影响

目的通过观察感染旋毛虫小鼠并发过敏性哮喘后血清及支气管肺泡灌洗液(BALF)中干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)和白细胞介素5(IL-5)水平的变化,探讨旋毛虫感染对过敏性哮喘小鼠的影响。方法随机将15只雌性BALA/c小鼠分为空白对照组(A组)、单纯过敏性哮喘组(B组)及感染旋毛虫后并发哮喘组(C组)各5只,建立单纯过敏性哮喘模型和感染旋毛虫后过敏性哮喘模型,取小鼠血清和BALF,采用酶联免疫吸附法进行检测,比较3组之间IFN-γ、IL-4及IL-5的差异。结果与A组比较,B组血清及BALF中的IFN-γ水平差异无统计学意义(P>0.05),IL-4、IL-5水平显著升高(P<0.05);而C组血清及BALF中的IFN-γ水平较A组显著升高(P<0.05),IL-4、IL-5水平差异无统计学意义(P>0.05)。C组与B组比较,血清及BALF中IFN-γ水平差异无统计学意义(P>0.05),而IL-4、IL-5水平显著降低(P<0.05)。结论旋毛虫感染对过敏性哮喘小鼠血清及BALF中IL-4、IL-5的表达有抑制作用,对IFN-γ无影响。

LC促进人成骨样MG-63细胞增殖及相关机制的研究

目的探讨大黄酸哌嗪雌酚酮(rhein-piperizinyl-estrone,LC)对人成骨样MG-63细胞增殖活性的影响及其相关分子机制。方法在原工作基础上,以兼有两种雌激素受体(estrogen receptor,ER)亚型表达的人成骨样MG-63细胞为研究对象,分别应用MTT法和流式细胞术,观察LC对MG-63细胞的增殖活性和细胞周期分布的影响。利用前期构建的ERα或ERβ稳定高抑制表达的MG-63细胞株,应用免疫印迹技术,对LC的作用机制和可能的信号通路进行研究。结果与对照组相比,LC可明显促进MG-63细胞的增殖活性,该作用具有剂量依赖性;可调节细胞周期分布,使G1期细胞比例减少、G2+S期细胞比例增加,进而促进细胞生长。进一步研究发现,ER阻断剂ICI 182,780可完全阻断LC的促增殖作用,提示LC是经ER途径对MG-63的增殖活性发挥作用的;利用ERα或ERβ高抑制表达的稳定细胞株,证实LC的促增殖作用是由ERα和ERβ共同介导的;该作用与Ras/MEK/ERK、PI3K/Akt信号通路的激活密切相关。结论 LC可经ERα和ERβ共同介导对人成骨细胞的促增殖作用,有望成为治疗绝经后骨质疏松症的新型骨靶向雌激素类药物。

红景天苷对成骨细胞的作用及相关分子机制研究

目的:研究红景天苷(SAL)对人成骨样MG-63细胞增殖、分化和HIF-1α依赖的VEGF表达的影响及相关分子机制。方法:采用MTS法、流式细胞术分析、RT-PCR、ELISA、Western blot等技术观察SAL对MG-63细胞增殖、分化和HIF-1α依赖的VEGF表达的影响,进一步探讨其相关分子机制。结果:SAL通过调控MG-63细胞的周期分布及上调Runx2和Osterix表达促进成骨细胞的增殖和分化。另外,SAL可明显上调下游靶基因VEGF的表达。结论:SAL可显著促进成骨样MG-63细胞的增殖、分化以及HIF-1α依赖的VEGF的表达,进而促进骨和血管新生。

NY-ESO-1/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、纯化及鉴定

目的:构建肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白NY-ESO-1/GST进行纯化和初步鉴定。方法:设计针对NY-ESO-1的特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)从睾丸组织的cDNA文库扩增NY-ESO-1基因片段,经上下游引物所引入的EcoR I和Xho I双酶切后克隆入原核表达载体pGEX-4T1中GST标签的下游,构建重组表达载体pGEX-4T1-NY-ESO-1,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达NY-ESO-1/GST融合蛋白,经不同浓度尿素洗脱纯化后,表达产物通过SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定。结果:重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定和IPTG诱导表达NY-ESO-1/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量(Mr)为44 000,与理论值相符,并主要以包涵体形式存在,灰度扫描分析显示融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的90%,Western blot结果证实该NY-ESO-1/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,提示为融合蛋白。结论:成功构建了NY-ESO-1基因原核表达载体pGEX-4T1-NY-ESO-1,利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的包涵体形式NY-ESO-1/GST融合蛋白。

葛根素促人成骨样MG-63细胞增殖的分子机制研究

【目的】研究葛根素对人成骨样MG-63细胞增殖的影响,并初步探讨其相关的分子作用机制。【方法】在前期研究工作的基础上,以同时表达两种雌激素受体(estrogen receptor,ER)亚型的人成骨样MG-63细胞为研究模型,通过RT-PCR、Western blotting及小RNA干扰等技术,探讨葛根素对人成骨细胞增殖的作用及作用机制。【结果】葛根素可显著促进MG-63细胞增殖,进一步研究发现葛根素可通过增加MG-63细胞Cyclin B1,Cyclin D1分子的表达水平使G1期细胞比例减少,G2+S期细胞比例增加。葛根素的上述作用能被纯ER阻断剂ICI 182,780部分阻断,利用小RNA干扰技术证实葛根素的促增殖作用是依赖ERα和ERβ的。【结论】葛根素对成骨细胞增殖作用的调节是通过ER途径,由ERα和ERβ共同介导的。

HIF-1α在肿瘤上皮-间质转化过程中作用的研究进展

低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)通过调节不同靶基因的转录活性及其表达,参与肿瘤增殖、凋亡、侵袭转移和血管发生等诸多环节,其过度表达与恶性肿瘤的不良预后密切相关。上皮-间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)已被证实在人肿瘤细胞的侵袭转移过程中起关键作用。研究发现,在低氧微环境中EMT相关转录因子过表达,而HIF-1α可介导这些转录因子的表达进而促进EMT过程。本文就HIF-1α在肿瘤EMT过程中的作用及研究进展做一综述。

旋毛虫感染对过敏性哮喘小鼠IL-4及IL-5的影响

目的通过研究旋毛虫感染鼠在过敏性哮喘发病时血清及支气管肺泡灌洗液中IL-4和IL-5的水平变化,探讨旋毛虫感染对过敏性哮喘的作用。方法取雌性、8周龄BALB/c小鼠20只,随机分为4组,A组为空白对照组,B组为单纯过敏性哮喘组,C组为感染旋毛虫后哮喘组,D组为单纯感染旋毛虫组。C、D组小鼠经灌胃法感染旋毛虫囊包幼虫200～300条;4周后,以卵清白蛋白(OVA)分别对B、C组小鼠进行致敏激发,建立过敏性哮喘模型;8周后,取小鼠血清、肺泡灌洗液,用ELISA法检测IL-4和IL-5水平。结果血清中A、B、C、D组小鼠IL-4水平分别为(136.4948±31.1670)、(209.8004±21.5652)、(162.7892±17.6829)、(182.7092±12.0841)pg/L;IL-5水平分别为(7.3101±1.8600)、(15.9997±2.28208)、(9.2411±1.7280)、(11.4135±2.10776)ng/L;与B组比较,C组小鼠IL-4、IL-5水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。肺泡灌洗液中A、B、C、D组小鼠IL-4水平分别为(169.1636±9.9997)、(232.9076±17.9501)、(172.3508±19.1895)、(193.0676±16.5708)pg/L;IL-5水平分别为(12.8618±1.7799)、(23.8460±5.507)、(15.7560±4.5419)、(20.3440±3.9713)ng/L;与B组比较,C组小鼠IL-4、IL-5水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论旋毛虫感染对过敏性哮喘小鼠IL-4、IL-5的表达有抑制作用。

ERα/β表达对人乳腺癌细胞增殖能力及他莫西芬敏感性的影响

【目的】研究ERα/β表达对人乳腺癌细胞增殖能力及他莫西芬(tamoxifen,TAM)敏感性的影响并探讨其机制。【方法】选择ERα^(high)/ERβ^(high)的人乳腺癌细胞MCF-7细胞,采用RNA干扰技术构建ERα/ERβ表达水平不同的乳腺癌细胞株;采用MTT法和RT-PCR技术对构建后乳腺癌细胞株的增殖能力、凋亡抑制基因表达以及TAM敏感性进行检测。【结果】与MCF-7细胞相比,构建后ERα^(low)/ERβ^(high)MCF-7/ERαsh RNA细胞的增殖能力降低(P<0.05),其凋亡抑制基因Bcl-2的表达亦降低(P<0.01);而ERα^(high)/ERβ^(low)MCF-7/ERβsh RNA细胞的增殖能力增强(P<0.05),其凋亡抑制基因XIAP、Bcl-xl和Bcl-2的表达均显著升高(P<0.01)。乳腺癌细胞TAM敏感性的检测结果显示,ERα^(high)/ERβ^(high)的MCF-7、MCF-7/scrambled sh RNA细胞和ERα^(high)/ERβ^(low)MCF-7/ERβsh RNA细胞均对TAM敏感(P<0.05),其中以ERα^(high)/ERβ^(low)MCF-7/ERβsh RNA细胞最为敏感(P<0.01);而ERα^(low)/ERβ^(high)MCF-7/ERαsh RNA细胞对TAM不敏感(P>0.05)。【结论】ERα可促进乳腺癌细胞的增殖及其对TAM的敏感性;而ERβ则抑制乳腺癌细胞的增殖及其对TAM的敏感性。

多梳蛋白Nspc1对微管基因Tubulin βⅢ启动子活性的影响

【目的】克隆TubulinβIII基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中并检测多梳蛋白Nspc1对其活性的影响。【方法】提取小鼠畸胎瘤细胞系P19的DNA,PCR扩增TubulinβIII近端启动子片段,构建2个不同长度的p GL3basic-TubulinβIII荧光素酶报告基因载体,双酶切及测序确定所扩增的DNA序列,将重组的报告基因载体与转录调控因子多梳蛋白Nspc1瞬时共转染小鼠畸胎瘤细胞系P19细胞,使用双荧光素酶报告基因检测系统检测Nspc1对TubulinβIII启动子活性的影响。【结果】鉴定结果表明构建的TubulinβIII启动子序列正确,P19细胞中双荧光素酶活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,并对转录调控因子Nspc1有应答。【结论】成功构建了TubulinβIII荧光素酶报告基因载体,为进一步在多能干细胞分化模型中研究多梳蛋白Nspc1对TubulinβIII基因的表达调控机制奠定了重要基础。

低氧反应元件荧光素酶报告载体的构建及鉴定

【目的】构建低氧反应元件(hypoxic response element,HRE)荧光素酶报告载体,以检测和分析细胞内低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF-1)表达。【方法】化学合成HRE的核心启动子序列(6×HRE),将其定向克隆入p GL3-BASIC,经PCR、酶切和测序鉴定,获得p GL3-HRE荧光素酶报告载体;然后以p GL3-HRE和β-gal DNA共转染MG63细胞,通过物理和化学低氧来检测其活性,并western blotting分析转染细胞HIF-1表达水平。【结果】获得了p GL3-HRE荧光素酶报告载体,PCR、酶切和测序鉴定均与预期一致;物理低氧(1%O2)和化学低氧(不同浓度Co Cl2)均可诱导转染MG63细胞荧光素酶表达水平的升高(P<0.05),其中以Co Cl(3002μmol/L)组最为显著,western blotting结果也显示Co Cl2(300μmol/L)组HIF-1表达水平更为显著(P<0.05),与荧光素酶表达趋势一致。【结论】成功构建了HRE荧光素酶报告载体,为进一步研究HIF-1的表达调控作用及筛选抗低氧药物提供了工具。

低氧与骨肿瘤

生态环境中的氧含量及其他组成要素对调控干细胞和肿瘤细胞的行为起了至关重要的作用。低氧与正常发育、疾病进展以及实体肿瘤生长有关。低氧诱导因子(hypoxia inducible factors,HIFs)是细胞对低氧免疫应答的主要介质。本文着重对HIFs对骨肿瘤形成的作用做综述,并进一步对低氧、干细胞及其生态环境如何调控骨肿瘤的形成进行阐述。