幽门螺杆菌ureI核酸疫苗免疫活性的初步研究

目的观察幽门螺杆菌ureI核酸疫苗诱导C57BL/6小鼠产生体液免疫应答及细胞免疫应答水平。方法重组质粒pcDNA3.1(+)/ureI、空质粒pcDNA3.1(+)及PBS分别肌注免疫C57BL/6小鼠。ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平以及脾淋巴细胞培养上清中IL-4和IFN-γ含量,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,PCR和免疫荧光组化法检测ureI基因和蛋白表达。结果 pcDNA3.1(+)/ureI能够诱导小鼠产生特异性IgG抗体,该组小鼠脾淋巴细胞经UreI重组蛋白刺激后,其刺激指数和培养上清中IL-4、IFN-γ含量明显升高;ureI基因可在小鼠肌细胞中有效表达。结论 pcDNA3.1(+)/ureI核酸疫苗能刺激C57BL/6小鼠产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答,为进一步研究该疫苗的免疫保护作用奠定了基础。

幽门螺杆菌Tipα蛋白激活NLRP3炎性小体诱导THP-1细胞分泌IL-1β和IL-18

目的以佛波酯(PMA)诱导分化的THP-1巨噬细胞为模型,探讨NLRP3炎性小体在幽门螺杆菌Tipα蛋白诱导炎性细胞因子分泌中的作用。方法采用重组纯化Tipα蛋白刺激巨噬细胞,ELISA检测其促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-18的分泌水平。分别用NF-κB通路阻断剂PDTC和ROS清除剂NAC预处理细胞,ELISA检测预处理前后Tipα诱导细胞分泌促炎细胞因子水平差异,Western Blot检测NLRP3和Caspase-1分子的表达水平差异。结果 Tipα蛋白可显著诱导巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β和IL-18;Tipα蛋白浓度为40μg/mL时,刺激细胞6h后,TNF-α、IL-18和IL-1β表达水平接近峰值(P<0.05)。特异性阻断NF-κB信号通路后,巨噬细胞分泌的促炎细胞因子及Caspase-1和NLRP3分子的表达水平均较阻断前明显降低,ROS清除剂NAC预处理细胞后,巨噬细胞分泌的IL-18和IL-1β较处理前有明显降低(P<0.05),TNF-α无明显变化;Western Blot结果显示Caspase-1和NLRP3分子的表达水平较阻断前均有明显降低。结论 Tipα能够促进巨噬细胞产生促炎细胞因子IL-1β和IL-18;NLRP3/Caspase-1途径可能参与了Tipα诱导的IL-1β和IL-18分泌。

血浆胆固醇含量对代谢综合征患者HDL亚类分布的影响

目的探讨代谢综合征(MS)患者血浆胆固醇水平对高密度脂蛋白(HDL)亚类分布的影响。方法采用全自动生化分析仪测定MS患者血浆血脂含量及载脂蛋白浓度,用双向电泳-免疫印记法测定血浆HDL亚类的含量。并根据中国成人血脂异常防治指南,将MS患者按血浆总胆固醇(TC)浓度分为3组,即TC正常范围组:TC<5.17 mmol/L、TC临界升高组:5.17 mmol/L≤TC<6.21 mmol/L、TC升高组:TC≥6.21 mmol/L。结果与对照组相比,MS患者血浆空腹血糖(FPG)、TC、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、载脂蛋白B100(apo B100)、preβ1-HDL、HDL3b含量及apo B100/AI和LDLC/HDLC比值均显著性增高(P<0.05或P<0.001),HDLC、apo AI、HDL2a、HDL2b显著降低(P<0.05或P<0.001);并且随着血浆TC水平的升高,小颗粒的preβ1-HDL和HDL3b含量升高,而大颗粒的HDL2a和HDL2b含量降低。MS患者HDLC的含量降低和(或)LDLC含量升高都存在不同程度的血浆HDL亚类分布异常,而且HDLC含量异常时存在HDL各亚类分布异常的程度较LDLC含量异常时更显著;当二者同时异常时,小颗粒的preβ1-HDL增加,大颗粒的HDL2b减少更加明显。直线相关和多元回归分析中发现,血浆TC、HDLC和LDLC含量紊乱与HDL亚类异常分布存在关联。结论 MS患者胆固醇含量与HDL亚类分布异常有关。

幽门螺杆菌与胃癌相关分子机制研究进展

因幽门螺杆菌（H.pylori）与胃癌的密切相关性,1994年世界卫生组织将其划归为I类致癌原。这种革兰阴性、微需氧菌持续寄生于胃粘膜,并成为其中的优势种群。虽然感染H.pylori通常是无症状的,但其与胃炎、消化道溃疡相关,严重时还会导致胃癌。近年来,胃癌已成为发生率位居世界第五的癌症,其死亡率高达75﹪,相关统计数据表明胃癌已成为癌症死亡第三位的原因。

鲍曼不动杆菌UspA蛋白的克隆表达及生物信息学分析

目的克隆表达及纯化鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)普遍应急蛋白A(Universal stress protein A.UspA).并进行生物学预测和分析。方法查询鲍曼不动杆菌UspA基因序列,设计特异性PCR引物,以提取的鲍曼不动杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增UspA片段。回收目的片段,连接到质粒pET28a.转化大肠埃希菌.37℃培养后,进行PCR扩增并测序。将重组质粒转入表达菌,加人IPTG诱导重组UspA蛋白表达.并经Ni2+亲和层析纯化。采用生物信息学软件分析UspA蛋白的生物学特性。结果获得全长为444 bp的鲍曼不动杆菌UspA基因,且成功构建了重组质粒pET28a-UspA.得到纯度较高的相对分子质量17X103的重组UspA蛋白。该蛋自为细菌的胞质蛋白,其a-螺旋占51%,延伸链占27%,无规卷曲的含量占31%。由2个同源UspA蛋白分子构成二聚体。结论成功克隆表达了鲍曼不动杆菌UspA蛋白。该蛋白可能含B细胞表位,而具有免疫原性,为其生物学活性及耐药机制研究提供了理论基础。

金黄色葡萄球菌锰超氧化物歧化酶的表达纯化及活性分析

目的克隆表达、纯化金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)并测定其活性。方法使用Clustal Omega比对不同来源Mn-SOD的序列,使用Swiss model网站预测金黄色葡萄球菌Mn-SOD的三级结构。提取细菌DNA,以此为模板PCR扩增获得Mn-SOD基因并将其与pET28a连接,构建pET28a-Mn-SOD重组质粒。将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)获得重组菌BL/pET28a-Mn-SOD,使用IPTG诱导表达重组Mn-SOD,通过镍柱亲和层析纯化Mn-SOD蛋白并测定不同pH条件下的酶活性。结果金黄色葡萄球菌Mn-SOD具有Mn-SOD的特征序列和锰离子结合位点。成功得到重组质粒pET28a-Mn-SOD,转化大肠埃希菌BL21后表达相对分子质量为24.8×10^3的Mn-SOD,使用Ni^2+柱纯化后得到高纯度的Mn-SOD,且在pH值为7.5时活性较高,约为3 200 U/mL。结论成功构建了pET28a-Mn-SOD重组质粒能,表达的Mn-SOD重组蛋白纯化后仍具有SOD活性。

幽门螺杆菌Tipα蛋白的表达、纯化及对胃癌细胞增殖和迁移的影响

目的表达并纯化重组幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)肿瘤坏死因子-α诱导蛋白(tumor necrosis factor-α-inducing protein,Tipα),观察其对胃癌细胞增殖和迁移的影响以及IL-6/STAT3信号通路在其中的作用。方法采用IPTG诱导表达Tipα重组蛋白并通过Ni2+亲和层析纯化,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot鉴定;使用重组Tipα蛋白刺激胃癌SGC7901细胞,分别采用CCK8、流式细胞术、划痕伤口愈合试验和Transwell试验检测其对细胞增殖、凋亡和迁移的影响。结果可溶性25×103重组Tipα蛋白被成功诱导表达且能被抗His-tag单克隆抗体所识别。与空白对照组相比,Tipα蛋白能够抑制SGC7901细胞凋亡(t=9.53;P<0.05)。与PBS组相比,Tipα组细胞的增殖和迁移能力增加,而IL-6单克隆抗体或STAT3抑制剂SH-4-54预处理能够减弱Tipα诱导的细胞增殖和迁移(CCK8实验,F=103.194,P<0.01;划痕伤口愈合试验,F=15.568,P<0.01;Transwell试验,F=36.017,P<0.01)。结论Hp Tipα蛋白可促进胃癌细胞增殖和迁移,IL-6/STAT3信号通路在其中发挥重要作用。

幽门螺杆菌Dps蛋白的表达、纯化及活性测定

[目的]表达及纯化重组幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)Dps(DNA protection during starvation)蛋白并测定其活性。[方法]依照Dps蛋白的基因序列,设计PCR引物,并以幽门螺杆菌基因组DNA为模板扩增Dps基因。将扩增产物回收后连接到pET15b然后转化大肠杆菌,涂布在抗性平板,37℃过夜培养,然后使用PCR和测序验证阳性菌落。使用IPTG诱导重组Dps蛋白表达,并通过Ni2+亲和层析纯化。测试Dps蛋白的亚铁氧化酶活性和抗氧化功能。[结果]通过PCR获得全长为438bp的Dps基因,成功构建重组质粒pET15b-Dps,它能编码分子量为18.9kDa的重组Dps蛋白。使用IPTG诱导目的蛋白表达,然后纯化得到Dps蛋白。Dps蛋白能够快速催化亚铁离子生成铁离子。与对照BSA蛋白相比,Dps蛋白具有较强的抑制氧自由基生成的活性。[结论]构建了重组质粒pET15b-Dps,纯化获得Dps蛋白并测定了其亚铁氧化酶活性和抗氧化活性。