猪源肺炎克雷伯菌荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了实现猪源肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)的快速检测,根据GenBank公布的猪源Kp Khe基因保守序列,设计引物和探针,建立了一种Kp荧光定量PCR快速检测方法,并对该方法的灵敏性、特异性及重复性进行评价。结果显示:该方法灵敏度高,最低检测限为10 copies/µL;特异性强,与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、猪2型链球菌、副猪嗜血杆菌、猪坏死杆菌、猪细胞内劳森菌和猪丹毒杆菌等病原均无交叉反应;重复性好,批内及批间变异系数均小于2%。采用本方法检测140份临床送检样品,本方法的阳性检出率高于细菌分离鉴定方法。以上结果表明,本方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可为猪源肺炎克雷伯菌病的诊断及防治提供更好的技术支持。

鸽圆环病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立快速灵敏检测鸽圆环病毒(Pi CV)的方法,参考Gen Bank上给出的中国流行Pi CV毒株序列(登录号:OL901205.1),合成了Pi CV的全基因组重组质粒,并依据Pi CV的Rep基因保守序列设计多组引物、探针,从中优选出1组扩增效果最佳的引物、探针,建立Taq Man荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的灵敏性,使用合成的标准重组质粒进行试验,最低检测限为21 copies/μL,且在标准质粒浓度2.1×10^(8)~2.1×10 copies/μL范围内具有良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.9991;该方法具有高度的特异性,仅与Pi CV发生特异性反应,不与鸽疱疹病毒1型、鸽腺病毒、新城疫病毒及鸽轮状病毒发生交叉反应;该方法的重复性亦佳,批间变异系数小于2%,批内变异系数低于1%。使用本方法检测50份疑似病料咽拭子样本,样本阳性检出率为94%,高于普通PCR的82%,两者符合率为100%。综上所述,建立的Pi CV Taq Man荧光定量PCR方法可用于Pi CV的临床检测。