人脐带间充质干细胞源性心肌细胞的纯化及生物学特性鉴定

目的探讨基因修饰的方法纯化人脐带间充质干细胞源性心肌细胞的可行性,为临床心肌细胞移植寻找新的干细胞来源。方法将人心肌球蛋白轻链(MLC-2v)基因启动子与嘌呤霉素抗性基因融合,然后转染人脐带间充质干细胞,通过嘌呤霉素筛选,纯化培养出MLC-2v阳性细胞,用5-氮杂胞苷进行诱导,检测诱导后MLC-2v阳性细胞是否表达心脏相关标记物。结果纯化培养出的MLC-2v阳性细胞经5-氮杂胞苷诱导后表达心肌细胞的标记物肌钙蛋白Ⅰ(troponinⅠ)、MLC-2v和结蛋白(desmin)。RT-PCR检测证实,人脐带间充质干细胞在转染及诱导前不表达Nkx2.5和desmin,经筛选诱导后细胞表达Nkx2.5和desmin。结论人脐带间充质干细胞通过基因修饰方法可以得到相对纯化的心肌样细胞,可能成为心脏细胞移植治疗重要的细胞来源。

尾加压素Ⅱ促进血管外膜成纤维细胞表达白细胞介素6

目的探讨尾加压素Ⅱ（UⅡ）对大鼠血管外膜成纤维细胞表达白细胞介素6（IL-6）作用的影响及其细胞内信号转导机制。方法雄性SD大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞体外同步化培养24 h后,于无血清DMEM培养基中加入UⅡ（10^-10^-10^-7mol/L）,共孵育3-24 h。为了探索UⅡ的作用机制,加入细胞内不同的信号转导通路抑制剂,处理30 min后,加入UⅡ（10^-8mol/L）共孵育3 h或12 h。实验结束时,收集细胞,采用逆转录-聚合酶链反应法检测细胞IL-6 mRNA表达（3 h）;另外,细胞实验结束后收集培养液,采用酶联免疫吸附测定法检测IL-6分泌水平（12 h）。结果 （1）UⅡ呈浓度（10^-10^-10^-7mol/L）和时间依赖性方式促进外膜成纤维细胞中IL-6 mRNA表达和蛋白分泌,至10^-8mol/L UⅡ达高峰（P〈0.01）;UⅡ（10^-8mol/L）刺激IL-6基因表达3 h达高峰,蛋白分泌24 h达高峰（P〈0.01）。（2）UⅡ促进外膜成纤维细胞表达IL-6的效应能被UⅡ受体阻断剂SB710411（10^-6mol/L）、钙离子通道阻断剂尼卡地平（10^-5mol/L）、丝裂原活化蛋白激酶抑制剂PD980959（10^-5mol/L）、蛋白激酶C抑制剂H7（10^-5mol/L）、Rho激酶抑制剂Y-27632（10^-5mol/L）和钙调神经磷酸酶抑制剂环孢霉素A（10^-5mol/L）所抑制（P〈0.01）。结论 UⅡ明显促进大鼠主动脉外膜成纤维细胞IL-6的表达,该作用通过激活UⅡ受体、钙离子通道、丝裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶C、Rho激酶和钙调神经磷酸酶信号途径来实现,提示UⅡ诱导外膜成纤维细胞表达IL-6升高可能是其参与动脉粥样硬化的重要机制之一。

碱性成纤维细胞生长因子在活性全层皮肤构建中的作用

目的:探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在活性全层皮肤(LSE)培养构建中的作用。方法:构建LSE,于培养基中添加30 ng/mL bFGF(添加组),未添加bFGF组为阴性对照,观察LSE组织形态学变化以及表皮角化细胞、成纤维细胞的增殖及分化状态。结果:添加组真皮较厚,历时4周,显著抑制了真皮的菲薄化;且发现添加组的表皮上层表现较多分化型keratin.keratin 1、10,而增殖型的keratin 6、16与未添加组比明显抑制。未添加组表皮真皮交界处,平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表现强烈;添加组α-SMA大部分被抑制。结论:bFGF提高了LSE的品质并可能在皮肤再生修复过程中起到维持真皮厚度,抑制瘢痕形成与增生,并促进表皮层早期成熟的作用。

人羊膜活性皮肤替代物修复巨痣切除术后创面的可行性及疗效研究

目的探讨临床应用以人羊膜为基质的活性皮肤替代物(amniotic membrane-living skin equivalent,AM-LSE)修复皮肤缺损的可行性。方法 2016年7月收治1例5岁颈肩背部先天性巨痣患儿。首先取其正常皮肤分离扩增表皮角化细胞和真皮成纤维细胞,再以自愿捐赠的人去上皮AM为基质,经气液面培养10 d构建含有真皮基质和重层分化表皮的AM-LSE。对AM-LSE行大体及组织学观察。手术切除巨痣至深筋膜层,遗留创面面积为20 cm×15 cm;覆盖胶原蛋白海绵人工真皮,2周后改用AM-LSE贴敷于肉芽创面,之后常规换药。术后观察AM-LSE成活以及创面修复效果。结果气液面培养10 d后,成功构建具有真皮层以及重层分化良好的表皮层的AM-LSE。临床修复术后见AM-LSE贴敷良好,逐渐扩大融合,至术后6个月其色泽接近正常皮肤,质地柔软,皮片间隙为淡红色瘢痕。组织学观察,可见呈柱状紧凑排列的基底层细胞,以及分化的棘细胞层、颗粒层以及角质层。真皮层内分布大量成纤维细胞以及血管,未见明显炎性细胞浸润。结论采用自体皮肤细胞构建的AM-LSE移植修复创面可行,术后能长期存活,且无排斥反应。