靶向GRP78的miRNA表达载体对人食管癌EC109细胞增殖的抑制作用

目的:探讨靶向葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)基因的miRNA真核表达质粒,对人食管癌EC109细胞增殖的影响。方法:设计合成4对针对GRP78的特异性miRNA干扰序列和1对阴性对照序列,定向克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体上,构建靶向GRP78的miRNA重组质粒:pcDNATM6.2-miR78-1、pcDNATM6.2-miR78-2、pcDNATM6.2-miR78-3、pcDNATM6.2-miR78-4,并通过脂质体法转染至HEK293细胞;杀稻瘟菌素筛选2周形成稳定转染细胞系;荧光显微镜检测转染效率。将筛选出的最佳干扰质粒转染至EC109细胞,采用RT-PCR法检测GRP78 mRNA的表达,CCK8法检测其对EC109细胞增殖的影响。结果:测序结果表明成功构建4种靶向GRP78的miRNA重组质粒,经转染和筛选,所有转染后HEK293细胞均有GFP的表达;与未转染组及阴性对照组(pcDNATM6.2-Ctrl)相比,4种干扰质粒组HEK293细胞中GRP78 mRNA的表达均下降(P<0.05);干扰效率以转染pcDNATM6.2-miR78-1为最高。pcDNATM6.2-miR78-1转染EC109细胞,与未转染组、pcDNATM6.2-Ctrl组相比,EC109细胞中GRP78 mRNA的表达明显下降[(0.38±0.02)vs(1.03±0.04)、(1.00±0.03),均P<0.05]。CCK8法检测结果显示,转染pcDNATM6.2-miR78-1干扰质粒12、24、48、72 h后,EC109细胞的增殖被显著抑制[(0.028±0.001)vs(0.086±0.010),(0.035±0.003)vs(0.155±0.011),(0.112±0.009)vs(0.389±0.008)、(0.169±0.013)vs(0.433±0.009);均P<0.05]。结论:4对靶向GRP78的miRNA表达载体构建成功,其中pcDNATM6.2-miR78-1干扰质粒沉默效果最佳,能有效抑制EC109细胞的增殖。