华南流感病毒NS1基因特性研究

为了解H9N2和H5N1亚型流行性感冒病毒株的NS1基因特性 ,采用RT PCR方法测定了 12株 2 0 0 0～2 0 0 3年间在华南地区分离的禽流感病毒株的NS1基因核苷酸序列 .测序显示 6株H9N2亚型流感病毒NS1基因开放阅读框 (ORF)长 6 5 4bp ,编码 2 17个氨基酸 .6株H5N1亚型毒株NS1基因ORF长 6 78bp ,编码 2 2 5个氨基酸 .核苷酸和氨基酸同源性分析表明 ,同一亚型分离株之间有很高的同源性 ,而不同亚型的H9N2和H5N1毒株之间存在较大差异 .BLAST分析表明 ,H5N1和H9N2亚型流感病毒分离株的NS1基因分别与近两年从香港特区和华南地区的鸭中分离的毒株A/Duck/HongKong/ 6 4 6 3/ 0 1(H5N1)、A/Duck/Shantou/ 2 14 3/ 0 1(H9N2 )有很高的亲缘关系 .该研究结果为进一步进行NS1功能研究奠定了基础 .

禽流感病毒的变异进化及其预防控制

流感病毒属于正粘病毒科，为有包膜单链负股RNA病毒，其基因组由7或8个基因片段组成。流感病毒包膜上有两种重要的表面蛋白，血凝素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuramidinase，NA），尤其是HA分子，除了能够和宿主细胞表面的HA受体特异性结合、介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合外，也是机体免疫系统识别和攻击的主要靶点。流感病毒根据其核蛋白（NP）和M1蛋白的差异，可分为甲、乙、丙（A／B／C）三型，其中甲型流感病毒根据HA和NA抗原性的差异又分为不同的亚型。

高致病性禽流感病毒H5N1中和抗体的单链抗体构建与活性鉴定

在本实验室研制出的多株针对H5N1血凝素的鼠单抗中,10F7对34株H5N1病毒株都有血凝抑制和中和活性,具有特异性高、反应性强、识别谱广的特点。通过基因工程构建10F7单链抗体(scFv)表达重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化scFv,经血凝抑制实验及中和实验检测其活性。结果在针对3株病毒的血凝抑制实验中,10F7scFv蛋白对其中2株H5N1病毒均显示出结合活性,而对H9毒株没有反应。在针对7株H5N1病毒的中和实验中,10F7scFv对5株病毒具有较好的中和能力。H5N1广谱中和抗体10F7的单链抗体构建,为进一步研制针对H5N1禽流感病毒的治疗性抗体奠定了基础。

流感病毒ns1基因的克隆及其原核表达载体的构建

为了解H5N1亚型流感病毒株的ns1基因特性及其规模制备NS1蛋白,首先将病毒在鸡胚中传代,从收获的尿囊液中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增流感病毒全长ns基因。测序显示H5N1亚型流感病毒NS1cDNA全长678bp,编码225个氨基酸。BLAST分析表明,Qa/ST/852/01(H5N1)病毒株ns1基因与近年来从华南地区分离的禽H5N1毒株的ns1基因有很高的同源性。之后采用PCR方法扩增ns1基因的cDNA片段,将其克隆到pGEX-4T-3载体中,与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因融合,构建重组质粒pGEX-4T-3/NS1cDNA,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达。SDS-PAGE和凝胶扫描分析,GST-NS1融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,并且以可溶形式存在,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的28.5%,表达产物经亲和层析纯化后蛋白质纯度达96%以上。经免疫印记证实重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。该表达载体的构建为获得大量NS1蛋白进行功能研究及抗体制备提供了基础。

用SPF莱亨鸡制备抗甲型流感病毒血清

目的 :制备甲型流感病毒的抗血清作为流感病毒亚型鉴定之用。方法 :用两株H1 1亚型流感病毒分别免疫成年、健康的SPF莱亨鸡 ,刺激其产生抗体。通过血凝抑制实验检测抗血清的抗体滴度。结果 :所有免疫SPF莱亨鸡都产生了抗H1 1亚型流感病毒的抗体 ,且血清抗体滴度差异较大。结论 :本实验所用方法简便 ,制备的抗体特异性强 ,产生的抗体可用于甲型流感病毒亚型鉴定。

免疫荧光法检测非典型肺炎患者血清抗冠状病毒抗体

目的 :检测非典型肺炎患者血清中抗冠状病毒抗体及其滴度变化 ,协助临床确诊非典型肺炎。方法 :间接免疫荧光法检测患者体内急性期和恢复期血清中的抗冠状病毒抗体。结果 :3例临床诊断非典型肺炎患者血清内有特异性抗冠状病毒抗体 ,且恢复期抗体滴度比急性期的滴度增高 4倍以上。结论 :用具有高度特异性的免疫荧光技术对怀疑感染非典型肺炎的患者进行血清学检测 。

冠状病毒感染细胞抗原片法检测SARS患者血清中特异性抗体

目的 :检测SARS患者血清中特异性抗冠状病毒抗体及其滴度变化 ,协助临床确诊SARS。方法 :用本次爆发SARS患者鼻腔抽吸液分离的冠状病毒感染新生恒河猴肾细胞 ,制备抗原片 ,用间接免疫荧光法检测患者体内急性期和恢复期血清中的抗冠状病毒抗体。结果 :汕头地区 7例SARS患者血清内均有特异性抗冠状病毒抗体 ,且恢复期抗体滴度比急性期的滴度增高 4倍以上。结论 :用冠状病毒感染细胞抗原片对怀疑感染SARS的患者血清进行特异性抗体检测 。