与凡纳滨对虾抗副溶血弧菌有关的6.0 kD血蓝蛋白降解肽段

以凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）为研究对象，采用人工感染、Tricine．SDS．PAGE、Western．blotting、MALDI-TOF／TOF、抑菌实验等方法对血蓝蛋白小分子降解肽段进行研究。结果发现，副溶血弧菌（Vibriopara-haemolyticus）刺激对虾24h后，与对照组相比，其血淋巴中新出现5个分子量为6．0～31．0kD的与兔抗血蓝蛋白抗体呈阳性的小分子条带。其中，分子量为6．0kD的a条带（命名为HMCp6肽段）与凡纳滨对虾血蓝蛋白具有高度同源性，对副溶血弧菌具有明显的抑菌活性，与对照组相比，存在极显著性差异（P〈0．01）。由此说明，HMCp6应该是对虾感染副溶血弧菌后所产生的一种新的小分子降解肽段，推测其在对虾抗感染防御中发挥重要作用。

凡纳滨对虾血蓝蛋白酶解多肽的凝集与抑菌活性

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,通过分子筛层析、Tricine-SDS-PAGE、Westernblotting、凝集实验、抑菌实验和Edman N端测序等方法探索血蓝蛋白酶解多肽的凝集和抑菌活性。结果发现,血蓝蛋白经胰蛋白酶酶解后可产生分子量约为6—70 k D的7条多肽,该酶解混合物对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有显著的凝集活性,与未酶解的血蓝蛋白相比,其凝集活性可提高4—16倍。在此基础之上,进一步分离纯化该7条多肽,发现多肽-3对副溶血弧菌表现出较强的抑菌活性,且具有较好的浓度依赖性。在浓度为75μg/m L时,其抑菌率为(93.76±1.60)%,与阴性对照组相比,存在极显著性差异(P<0.01)。进一步研究显示该多肽位于血蓝蛋白N端α-螺旋区域。由此推测,凡纳滨对虾血蓝蛋白在体外经胰蛋白酶酶解后可产生具有凝集、抑菌等免疫活性的多肽,这对研究血蓝蛋白的降解机制及其在先天免疫中的作用具有重要意义。

与不同病原菌相结合的凡纳滨对虾血蓝蛋白溶血活性对比分析

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象,采用亲和孵育、PAGE、SDS-PAGE、Western-blotting、溶血活性测定等技术,探索与6种不同病原菌相结合的血蓝蛋白溶血活性的差异。结果发现,与副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、河弧菌(Vibrio flurialis)、大肠杆菌(Escherichia coli K12)、乙型链球菌(Beta Streptococcus)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)6种不同细菌相结合的血蓝蛋白(分别命名为HMC-VP、HMC-VA、HMC-VF、HMC-EC、HMC-BS、HMC-SA)对鸡红细胞表现出不同的溶血活性,其中HMC-VP、HMC-SA溶血活性最高(100.00%),HMC-VA溶血活性最低(39.68%)。在此基础之上,进一步采用糖基氧化和胰蛋白酶消化等策略探索引起该6种血蓝蛋白溶血活性差异的分子基础。结果表明,该6种血蓝蛋白经糖基氧化后,溶血活性大幅度下降抑或丧失,而经胰蛋白酶水解后,溶血活性大幅度升高抑或达到100.00%。由此说明,与不同病原菌相结合的血蓝蛋白免疫学功能(溶血活性)存在显著性差异,造成该差异的原因可能与血蓝蛋白的糖基化修饰、蛋白构象的多样性有关。

锯缘青蟹血蓝蛋白抑菌活性及其作用靶标

采用抑菌实验和抑菌抑制实验等方法探索锯缘青蟹(Scylla serrata)血蓝蛋白抑菌活性及其作用靶标。结果显示,锯缘青蟹血蓝蛋白对溶藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)、大肠杆菌K12(Escherichia coli K12)等细菌具有抑菌活性,其对大肠杆菌K12的抑菌活性可被大肠杆菌K12外膜蛋白(Outer membrane protein,Omp)所抑制,尤其是血蓝蛋白对大肠杆菌K12外膜蛋白敲除菌ΔOmpX、ΔOmpC、ΔOmpT、ΔTsx、ΔFadL和ΔOmpW的抑菌活性显著降低,与对照组相比,具有极显著性(P<0.01)和显著性差异(P<0.05)。由此说明,锯缘青蟹血蓝蛋白具有抑菌活性,其抑菌作用靶标可能为多种外膜蛋白。

血蓝蛋白免疫学功能、分子基础与应用新进展

一般认为,血蓝蛋白是节肢动物和软体动物血淋巴中的一种含铜呼吸蛋白.但随着研究的深入,人们发现血蓝蛋白还是对虾等无脊椎动物中的一种多功能免疫因子.本文对近年来国内外学者在血蓝蛋白免疫学活性、功能多样性分子基础及其应用前景等方面的研究新进展进行概述,为揭示血蓝蛋白在无脊椎动物免疫防御中的作用和地位奠定基础.

无脊椎动物先天免疫分子研究概述

本文概述无脊椎动物先天免疫分子的重要组分（酚氧化酶、凝集素、抗菌肽、血蓝蛋白、补体系统和纤维蛋白原相关蛋白）及其作用，以及无脊椎动物识别病原相关分子的模式受体。

源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的化学合成肽段的免疫调控活性

以源于血蓝蛋白化学合成肽段B1为研究对象,运用蛋白质组学、分子生物学等策略分析其对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的免疫调控活性。结果显示,与对照组比,对虾在受到肽段B1刺激后,血浆中2条分子量分别为65 kD和35 kD的蛋白条带(分别命名为p65和p35)表达水平显著上调。经质谱和Western blot鉴定,p65、p35与包括对虾β-1,3-葡聚糖结合蛋白、葡聚糖模式识别脂蛋白、血蓝蛋白等在内的13个蛋白具有高度同源性,其中p65与兔抗血蓝蛋白抗体呈明显的阳性反应。实时荧光定量PCR检测显示,肽段B1刺激对虾24 h后,5个质谱鉴定免疫相关基因:血蓝蛋白大亚基、血蓝蛋白小亚基、谷氨酰胺转氨酶、α2巨球蛋白亚型2、葡聚糖模式识别脂蛋白在肝胰腺、鳃和血细胞等组织中mRNA的表达水平显著性(P<0.05)或极显著性(P<0.01)上调。由此推测,源于凡纳滨对虾血蓝蛋白的化学合成肽段B1对包括血蓝蛋白在内的多种免疫因子的表达具有一定的调控作用。

源于凡纳滨对虾血蓝蛋白化学合成肽段的抗黑曲霉活性

选用黑曲霉(Aspergillus niger)为研究材料,采用滤纸片法、显微观察和电镜分析等方法探索12种源于凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血蓝蛋白化学合成肽段的抗黑曲霉活性。结果发现,6种合成肽段(B2、B10、B13、B14、S7和S9)在80μg/mL时能不同程度地抑制黑曲霉的生长,抑制率为30%~100%,其中,S7和B10抑制效果最佳。在此基础上,进一步选用B10分析其对黑曲霉孢子数目和形态的影响。结果显示,B10不仅可以明显延迟黑曲霉孢子的生长,而且还可以显著抑制孢子囊的发育。由此推测,对虾血蓝蛋白可能可以降解产生具有抗黑曲霉活性的功能性肽段,这对进一步阐明对虾血蓝蛋白功能性降解肽段的免疫学活性及其作用机制具有重要价值。

基于不同纯化策略的4种对虾血蓝蛋白的凝集活性及分子基础对比分析

既往研究表明,对虾血蓝蛋白(hemocyanin, HMC)是一种具有抗病毒、抗菌等多种免疫学活性的免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily, IgSF)分子,但迄今为止,其功能多样性的分子基础尚不是很清楚。本研究以凡纳滨对虾HMC为研究对象,采用亲和层析、凝集素层析技术获得4种HMC成分:A-HMCs、A-HMCl、AL-HMCs和AL-HMCl,发现其对不同细菌的凝集活性存在较大差异。其中,AL-HMCs和AL-HMCl对大肠杆菌和副溶血弧菌的凝集活性明显强于A-HMCs和A-HMCl,前者约为后者的2～32倍。继而,通过双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和凝集素印迹技术对不同HMC的蛋白质组成和糖基化修饰水平进行对比分析。结果显示,4种HMC在2-DE图谱上表现为6～7个差异明显的蛋白质点,且与伴刀豆凝集素(concanavalin A, ConA)、花生凝集素(peanut agglutinin, PNA)、荆豆凝集素(ulex europaeus agglutinin, UEA)和双花扁豆凝集素(dolichos bifows agglutinin, DBA)等4种凝集素的识别存在显著性差异。其中,A-HMCl 6个蛋白点均可识别4种凝集素,而A-HMCs 6个蛋白点中仅有4、3个点分别与UEA、DBA反应呈阳性,AL-HMCs和AL-HMCl可以与UEA、PNA特异性显色的点分别为其总蛋白点的3/7、2/6。由此推测,对虾血蓝蛋白功能多样性的分子基础可能与其蛋白质组成和糖基化修饰水平的多样性密切相关。

人血红蛋白凝集活性的研究

目前研究证实,人血红蛋白不仅具有输氧功能,而且具有酚氧化酶活性、抑菌活性等非特异性免疫学活性.本课题运用生物信息学技术对人血红蛋白与凝集素进行同源性分析,结果显示人血红蛋白α、β亚基与人、牛、大鼠、家鼠、非洲爪蟾、斑马鱼凝集素均存在同源区域,同源性大小为20%~46.7%.进而采用玻片凝集法与糖抑制实验探索人血红蛋白的凝集活性,结果表明人血红蛋白对副溶血弧菌等6种细菌均存在明显的凝集活性,其凝集比活为3.9~15.6 mg/L,且α-D-葡萄糖、麦芽糖、α-D-乳糖、D-半乳糖、D-山梨糖、D-木糖和N-乙酰神经氨酸可以部分或全部抑制人血红蛋白的细菌凝集活性.由此说明,人血红蛋白确实具有凝集活性,所获研究结果为进一步探索人血红蛋白的免疫学活性及其作用机理奠定了良好的基础.