RT-RAA联合CRISPR/Cas12a快速检测新型冠状病毒方法的建立与评价

目的建立一种基于反转录酶-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)联合簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a系统的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法,并对其进行评价。方法根据NCBI数据库中SARS-CoV-2的核衣壳(N)基因设计RT-RAA引物和CRISPR来源RNA(crRNA),优化检测体系中乙酸镁(MgAc)用量、RT-RAA反应温度和时间以及LbCas12a反应温度。以100~106 copies/μL重组质粒和其他呼吸道病原体分别评估该方法灵敏度和特异性。采用RT-RAA-CRISPR/Cas12a法和RT-PCR法对70份临床标本进行平行检测,比较两种方法的符合率。结果优化后的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法可在37℃条件下50 min内完成SARS-CoV-2检测。荧光法检测灵敏度为10 copies/μL,侧流层析法为1×102 copies/μL。该方法能特异检测SARS-CoV-2,与其他呼吸道病原体无交叉反应。RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测70份临床标本的结果与RT-PCR法完全一致,符合率为100%。结论建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测SARS-CoV-2快速、经济、灵敏度高、特异性强,无需昂贵仪器设备,可由经验不足的人员操作,为临床快速诊断和现场大规模筛查SARS-CoV-2提供了新的思路和方法。

XRCC1基因多态性与食管鳞癌放疗敏感相关性分析

目的了解食管鳞癌患者的X射线交错互补修复基因1(X-ray repair cross complementing group1,XRCC1)的4个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点的分布情况及其与放疗敏感性的关系。方法提取175例食管鳞癌患者外周血DNA,通过特异性引物PCR扩增XR CC1的4个SNP所在基因片段,测序及BLAST多态性分析,并与放疗结果相结合,分析SNP与放疗疗效的相关性。结果175例食管鳞癌患者中有112例能成功扩增并测序XR CC1中4个SNP位点。112例患者全组放疗近期有效率为84.8%,其中,4个SNP位点均未变异的基因型组有效率为74.3%,有1个以上SNP变异的基因型组有效率为89.6%(χ^(2)=4.389,P=0.036);单独第4个SNP位点(G28152 A,Arg399Gln)变异的基因型组和所有含第4个SNP位点变异组有效率分别为91.2%和91.5%,与未变异的基因型组比较差异有统计学意义(χ^(2)=4.014,P=0.045和X2=4.451,P=0.035)。结论XRCC1中SNP变异基因型组与食管鳞癌患者放疗敏感性相关。其中,第4个SNP位点变异的基因型可能是放疗敏感的预测指标。

2018—2019年赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫抗药性基因多态性分析

目的调查赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫多药耐药蛋白1(Plasmodium falciparum multidrug resistance protein1,PfMDR1)、氯喹抗性转运蛋白基因(P.falciparum chloroquine resistant transporter,PfCRT)和Kelch 13基因(P.falciparum Kelch 13,PfK13)多态性,为当地疟疾防控策略制定提供参考。方法采集2018—2019年赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫感染者外周血样本85份,提取基因组DNA。采用巢式PCR技术扩增、PfCRT和基因,对扩增产物进行DNA测序,并对基因序列进行比对。结果赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫基因不存在已知与青蒿素抗性相关的突变;PfMDR1基因和PfCRT基因均存在不同比例抗药性突变,其中PfMDR1N86Y、PfMDR1Y184F和PfCRTK76T突变率分别为35.29%(30/85)、72.94%(62/85)和24.71%(21/85)。结论赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫PfMDR1、PfCRT基因和基因均存在不同程度突变。

荧光重组酶聚合酶扩增/CRISPR-Cas12a快速检测恶性疟原虫方法的建立与初步评价

目的建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR-Cas12a系统的荧光快速检测恶性疟原虫方法,并对其检测效能进行初步评价。方法选择恶性疟原虫18S核糖体RNA(rRNA)基因为靶序列,设计和合成3组RAA引物及CRISPR来源RNA(crRNA),选择最佳组合并优化反应条件,建立荧光RAA/CRISPRCas12a检测方法。构建包括靶标区的恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因质粒,将质粒浓度分别稀释成1000、100、10、1拷贝数/μL进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测敏感度;分别以间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫、乙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、梅毒螺旋体基因组DNA为模板,进行荧光RAA/CRISPR-Cas12a反应,评价荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测特异度。分别采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法和巢式PCR法对50份疟疾临床样本进行检测,比较两种方法检测一致性。体外培养恶性疟原虫3D7株,经培养后获得的培养物采用健康人O型红细胞悬液稀释成1000、500、200、50、10个/μL等不同虫密度血液样本,以荧光RAA/CRISPR-Cas12a法进行检测,评价检测效果。结果选择Pf-F3/Pf-R3/crRNA2作为引物组合、2.5μL作为B buffer添加量、40 min作为RAA反应时间和37℃作为CRISPR-Cas12a反应温度建立荧光RAA/CRISPR-Cas12a法,其可检出浓度为1拷贝数/μL的含恶性疟原虫3D7株18S rRNA基因的质粒;该法检测恶性疟原虫可见荧光信号,但检测卵形疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫及阴性对照均无荧光信号,且与梅毒螺旋体、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒等其他病原体亦无交叉反应。采用荧光RAA/CRISPRCas12a法和巢式PCR法分别检测50份疟疾临床样本,两种方法检测结果完全一致(kappa值=1.0,P<0.001)。恶性疟原虫3D7株经6d体外培养,获得10 mL培养物,采用荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测稀释后的临床样本,得到最低检测限为50个疟原虫/μL。结论荧光RAA/CRISPR-Cas12a法检测恶性疟原虫快速、敏感、特异,有望用于恶性疟原虫快速检测和风险监测。

2018-2020年赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫青蒿素耐药相关基因Pfubp1和Pfap2mu的单核苷酸多态性分析

目的了解赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫分离株青蒿素耐药相关基因Pfubp1和Pfap2mu的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)流行情况,为该地区疟疾防治方案的制定提供基线数据。方法采集2018—2020年赤道几内亚Bioko岛恶性疟患者临床血样184份,提取血样中恶性疟原虫基因组DNA。采用巢式PCR技术和Sanger测序法检测恶性疟原虫Pfubp1和Pfap2mu基因,并对基因序列进行比对分析。结果赤道几内亚Bioko岛分离株恶性疟原虫Pfubp1基因中,无突变虫株占88.83%(159/179)。20株突变虫株(11.17%,20/179)共分离出6个不同SNPs,该6个SNPs有4个非同义突变,分别为E1516G、K1520E、D1525E、E1528D;95.00%(19/20)的突变分离株中仅有1个基因突变位点,其中非同义突变占68.42%(13/19)。与以青蒿素为基础的联合疗法(artemisinin⁃based combination therapies,ACTs)耐药相关的Pfubp1基因中,D1525E和E1528D为已知主要流行突变位点;在第1525位点氨基酸,野生型虫株占99.44%(178/179)、突变型虫株占0.56%(1/179),该突变位点仅在2018年采集的样本中发现;在第1528位点,野生型虫株占93.30%(167/179)、突变型虫株占6.70%(12/179)。在Pfap2mu基因3个区域(Pfap2mu⁃inner1、Pfap2mu⁃inner2、Pfap2mu⁃inner3)的目标扩增片段中,野生型虫株所占比例分别为95.72%(134/140)、79.25%(126/159)和95.83%(161/168);在所有测序成功的样本中筛出16个不同SNPs,共有7个非同义突变,分别为S160N、K199T、A475V、S508G、I511M、L595F、Y603H;43株突变分离株中,有1个以上突变位点的占16.28%(7/43),其中非同义突变占28.57%(2/7)。与ACTs相关的已知延迟清除位点为S160N,野生型虫株占89.94%(143/159)、突变型虫株占10.06%(16/159)。结论赤道几内亚Bioko岛恶性疟原虫Pfubp1和Pfap2mu基因均发生不同水平突变,Pfubp1基因突变型比例低、Pfap2mu基因突变型比例较高,本研究还发现了Pfubp1 E1504E、K1520E和Pfap2mu A475V、S508G等新位点。