乳酸菌强化技术降低黄酒浸米过程生物胺的积累

食品中适宜浓度的生物胺具有调节生理机能的作用,然而含量过高会产生不良反应。黄酒浸米过程可形成大量的生物胺,并随大米进入发酵过程,导致黄酒中生物胺浓度过高。为控制浸米环节生物胺的积累,本研究在解析浸米水微生物群落结构的基础上,将筛选的1株生长和产酸能力强且能够降解生物胺的植物乳杆菌14-2-1扩培后接种于浸米起始阶段,使浸米水中酸度增加速率明显提高,群落中植物乳杆菌的占比由传统工艺的0.95%升至79.52%,形成以植物乳杆菌为主的群落结构,同时生物胺质量浓度(2.44 mg/L)降低93.84%。基于浸米水微生物群落结构解析结果设计的乳酸菌强化技术,大幅降低了浸米工序中生物胺的质量浓度,为有效控制浸米过程中生物胺的积累,降低黄酒中生物胺的质量浓度提供一个新的方法。

谷氨酸脱羧酶基因工程改造研究进展

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一种具有重要生理功能的天然氨基酸,广泛应用在医药、食品、化工等行业。利用谷氨酸脱羧酶催化法合成GABA因其反应条件温、对环境友好和原料易得已成为当前研究的热点。该研究论述了催化合成GABA关键酶谷氨酸脱羧酶的分子改造、基因工程菌构建等研究进展。

产阿魏酸酯酶的枝状枝孢霉筛选、发酵特性及在黄酒中应用研究

筛选高产阿魏酸酯酶菌株,并对其发酵特性及在黄酒中的应用进行研究。通过初筛及复筛,根据菌落形态、生理生化特征及rDNA ITS1-5.8S-ITS2基因序列的系统发育树构建分析进行菌株鉴定;以阿魏酸含量为衡量指标,考察温度、初始pH、麦麸添加量、酒度等因素对菌株发酵过程中产阿魏酸的影响;菌株经过富集培养反添加到黄酒酿造过程中。筛选出一株高产阿魏酸酯酶霉菌,经分子鉴定为枝状枝孢霉菌株(Cladosporium cladosporioides),保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M2015549。菌株在30℃、pH 4.8、麦麸添加量5%、酒度9%条件下培养3 d,菌株产阿魏酸酯酶活力最高可达175.4 U/L。当菌株添加量为0.010%时,黄酒阿魏酸含量提高到150%。筛选到一株新的高产阿魏酸酯酶的枝状枝孢霉菌株,并将其反添加到黄酒酿造过程中,对黄酒阿魏酸含量的提高起到积极作用,证明菌株在产阿魏酸酯酶及富含阿魏酸功能性食品开发方面具有很大潜力。

醋酸高产菌株的筛选及高酸度苹果醋的酿造

国内外对适合酿造高酸度果醋(总酸质量浓度>100 g/L)的菌株选育和工艺开发等研究较少,为生产高酸度苹果醋,提高原料利用率,作者筛选得到一株高产醋酸的巴氏醋杆菌CYD159,并采取流加发酵的方法,探究了乙醇体积分数和分割取醋对发酵的影响。结果表明,当初始乙醇体积分数为3%,并控制流加速率,使发酵过程中乙醇体积分数不超过3%,分别在36、66、85 h分割3次时,可得到总酸(以乙酸计)120 g/L的高酸度苹果醋,是单批发酵总酸的2倍。

中国酿造食醋风味轮的构建及应用

利用建立的食醋感官评价小组,对中国主要的酿造食醋进行了风味评价。首次构建了中国酿造食醋的风味轮,其中包括16个类别共45个描述词。运用方差分析、主成分分析等方法筛选出了16个能够描述中国酿造食醋风味差异的词汇,其中味觉描述词包括酸味、甜味、鲜味、咸味、涩味、苦味6个,嗅觉描述词包括酸气、甜香、焦香、酱香、果香、麸皮香、烟熏香、米香、酒香、花香10个。对选择的酿造食醋样品进行感官描述性分析,发现不同类型的酿造食醋风味有明显差异。

降柠檬酸菌株的筛选及鉴定

为筛选具有降柠檬酸能力的酵母菌株,对一柠檬酸厂废水废渣中的微生物进行培养分离纯化保藏,共获得具有耐柠檬酸的菌株15株。对15株菌株的降柠檬酸能力进行测试,发现5株菌的降柠檬酸能力较强,发酵5d可降解柠檬酸培养基中70%以上的柠檬酸。测定5株菌的酒精耐受性,菌株NS2、NL2的酒精耐受能力较强。观察该两株菌的形态学及生理生化特性,将NS2鉴定为毕赤酵母菌,NL2鉴定为热带假丝酵母菌。进一步通过分子生物手段进行18SrDNA PCR测序分析,将NS2鉴定为Pichia kudriavzevii,NL2鉴定为Candida tropicalis。研究成果可为今后应用生物降酸法降低山楂酒等果酒中有机酸含量提供指导。

不同种类大米黄酒酿造的差异性分析

为探究不同种类大米的酿酒特性,以粳糯米、籼糯米、粳米和籼米4种大米为原料,采用绍兴工艺进行了酿酒实验,监测发酵过程中基本理化指标(乙醇体积分数、还原糖、总酸等)的动态变化,并对发酵液中醇、醛、酸、酯类挥发性风味物质的质量浓度进行分析。结果表明,采用粳糯米进行酿酒时易糖化,发酵速度较快,产乙醇速率高,后酵结束时醪液乙醇体积分数达到18%,且残糖质量浓度相对较高。发酵结束时,不同种类大米原料黄酒发酵液中的氨基酸主要是甜味氨基酸和苦味氨基酸,甜、苦、鲜、涩氨基酸质量浓度均存在显著性差异(p<0.01);籼米发酵液中氨基酸质量浓度最高,其次是粳糯米;粳糯米发酵液的挥发性风味物质的质量浓度及醇类化合物质量浓度上有明显优势,而籼糯米酿造原酒的酯类化合物质量浓度最高。

重组大肠杆菌全细胞催化合成4-羟基异亮氨酸

4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种很有前景的药物,它具有促进胰岛素分泌、改善外周组织对胰岛素的抵抗性和调节血脂异常等作用,而L-异亮氨酸羟化酶(IDO)常用于4-HIL的生产。首先,克隆了苏云金芽孢杆菌来源的L-异亮氨酸羟化酶,实现了其在E.coli BL21(DE3)中的异源表达。其次,通过同源建模和蛋白质结构分析,本着将与底物氨基酸侧链结合的氨基酸残基从亲水性或长链疏水性结构突变成丙氨酸Ala的原则,对I156位点进行了定点突变,以增大底物结合口袋,扩宽底物通遒进而提高4-HIL的产量。最后,对野生酶及突变酶的酶学性质、突变酶的羟基化反应体系进行研究,在最优催化条件下,分批补料转化底物进行4-HIL的生产。酶学性质结果显示,野生酶及突变酶I156A的最适温度均为25℃,最适pH均为7.0;突变酶I156A比酶活比野生酶提高了1.9倍,L-ILe转化率提高了28%。羟基化反应体系的最优转化条件为:20 mmol/L L-ILe,20 mmol/Lα-酮戊二酸,8 mmol/L Fe^(2+),30 mmol/L抗坏血酸和HEPES(50 mmol/L,pH 7.0)缓冲液。在最优转化条件下,重组菌E.coli BL21/pET28a-ido^(I156A)进行分批补料转化底物,时间间隔为4 h,32 h后得到77.3 mmol/L 4-HIL,底物最高转化率98.35%e。

高产谷胱甘肽酿酒酵母选育及保健功能苹果酒开发

苹果酒在生产和储运过程中的褐变严重影响苹果酒品质,而酵母菌的代谢产物谷胱甘肽可以抑制苹果酒的褐变。选用实验室筛选出的一株高产谷胱甘肽(GSH)菌株Y-18为出发菌株,利用紫外诱变和硫酸二乙酯(DES)诱变,用96孔板高通量初筛产GSH菌株,用摇床发酵培养复筛,以发酵力及产GSH能力为指标,复筛出高产GSH的优良苹果酒酵母,并对诱变条件和酵母生产GSH的发酵条件进行研究。经过96孔板高通量筛选出的突变株Y18-20在模拟苹果酒发酵条件的培养基中GSH浓度高达46.8mg/L,单位细胞产GSH能力为8.95 mg/g,是出发菌Y-18的2.18倍。96孔板高通量筛选方法具有节约经济成本、提高筛选效率、缩短选育周期的优势,选育出的优良高产GSH的突变菌株Y18-20,有比较好的发酵特性和遗传稳定性,对生产高谷胱甘肽苹果酒、抑制苹果酒褐变从而提高苹果酒品质具有现实意义。

高产洛伐他汀红曲菌的筛选及菌种共酵对红曲固态发酵的影响

本研究以筛选高产洛伐他汀红曲菌,并进一步优化富含洛伐他汀的红曲制曲方法为目的,分离筛选市售红曲中的红曲菌,并进行固态发酵制曲,使用HPLC法对红曲中的洛伐他汀含量进行测定,使用紫外分光光度法检测红曲的色价,选择产洛伐他汀含量最高的菌株进行形态观察和分子生物学鉴定;并进一步将高产菌株与常用食源菌株进行共酵制备红曲,优化洛伐他汀的含量。结果表明,分离筛选得到10株红曲菌,产洛伐他汀最高的菌种是H8-2,经固态发酵14 d后洛伐他汀产量达到9.79 mg/g,色价为1805.43μ/g。菌株H8-2经形态观察和生物学鉴定为紫色红曲菌(Monascus purpureus)。共酵制曲发现除枯草芽孢杆菌外其他菌种均可提高红曲菌产洛伐他汀含量,其中酵母对洛伐他汀产量提高的效果最显著(p<0.01),发酵结束后洛伐他汀含量可达12.37 mg/g。进一步对实验室保藏的多株酵母菌株进行评价,发现酿酒酵母对洛伐他汀产量提高最为明显,共酵后红曲中洛伐他汀含量达到12.93 mg/g,相比未共酵条件下的洛伐他汀产量提高了34.5%。在红曲菌发酵培养基中添加不同酿酒酵母处理液,发现高温灭菌液和酵母破壁液可以使洛伐他汀产量显著提高(p<0.01),分别可达11.96和12.24 mg/g,比对照组提高了24.8%和27.8%。说明酵母的代谢产物对红曲菌发酵产洛伐他汀有一定影响,相关诱导物质可能存在于胞内并且对热不敏感。

果胶酶低温处理山楂鲜果浆制备山楂酒工艺优化

由于山楂中存在大量果胶,制作山楂酒需对山楂果浆进行澄清处理。现有工艺多采用高温浸提或高温酶解的方式,两种处理方式温度较高,对山楂风味及营养都有不利影响。本研究通过优化果胶酶的处理温度、添加量、处理时间等条件,开发新型低温酶解工艺处理山楂鲜果浆,进而制备发酵山楂酒。本研究发现在35℃条件下添加0.15 m L/L果胶酶处理4 h后,山楂鲜果浆的透光率可高达93%。同时该工艺相比未添加果胶酶处理的山楂果浆,还原糖含量由8.2 g/L上升至14.2 g/L,总酸含量从5.5 g/L上升至7 g/L,对还原糖和总酸的提取效果较好。测定35℃处理山楂果浆主要风味指标优于果胶酶55℃酶解处理发酵的山楂酒。

不同种类可同化氮素对黄酒酵母产高级醇能力的影响

为研究不同种类可同化氮素对黄酒酵母产高级醇的影响,通过添加不同种类可同化氮素进行2株黄酒酵母的发酵实验,使用GC-MS对发酵液中高级醇进行测定,比较发酵结束时高级醇含量变化。结果表明:RWBL Y1739 LZH异戊醇合成能力较强,RWBL Y1615 ZCβ-苯乙醇合成能力较强;可同化氮素的添加对酵母生长、乙醇产生有着重要影响;对于酵母RWBL Y1739 LZH和RWBL Y1615 ZC,无机氮素降低高级醇的效果最好(29.97%~63.15%),氯化铵降低高级醇的幅度最大(62.60%,63.15%),添加特定的氨基酸能加强酵母Ehrlich途径,产生更多高级醇。

高产β-苯乙醇黄酒酵母的选育

黄酒中重要的风味物质β-苯乙醇主要由黄酒酵母(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)代谢产生,提高黄酒酵母β-苯乙醇产量可显著提升黄酒风味。本研究以绍兴地区酿酒酵母为紫外诱变出发菌株,对紫外诱变菌株进行底物类似物抗性筛选、酒精耐受性筛选、黄酒模拟液筛选,得到可提高β-苯乙醇产量的正突变菌株,再经产孢纯化与筛选得正突变菌株BYC-3。在发酵体系不外源添加前体化合物情况下,正突变菌株BYC-3菌株β-苯乙醇产量达238.12 mg/L,是出发菌株的2.67倍,其产酒精能力与出发菌株没有显著性差异,可为高品质黄酒开发提供参考。

分散液液微萃取和气质联用测定葡萄酒中的主要高级醇

高级醇是酒精饮料中重要的风味化合物。建立了一种基于分散液液微萃取(DLLME)结合GC-MS测定葡萄酒中4种主要高级醇的方法。通过优化样品酒度、pH、萃取剂、萃取剂体积、分散剂、分散剂体积、样品体积、盐浓度和萃取时间,获得了最佳的DLLME参数:样品酒度12%vol以下,pH和离子强度无需调节,800μL二氯甲烷作为萃取剂,1.0 mL乙腈作为分散剂,7 mL的葡萄酒样品,提取时间1 min。方法的相关系数(r)为0.9907~0.9994,均大于0.99。检测限(LOD)为(0.09~0.75)mg/L,定量限(LOQ)为(0.32~2.49)mg/L,均低于葡萄酒中的浓度。RSD均低于4.5%,重复性良好。利用该方法对不同甜型的成品葡萄酒中的高级醇进行加标回收,回收率为81.57%~111.15%。

双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD在谷氨酸棒杆菌JNR中的功能

【目的】通过改造谷氨酸棒杆菌JNR中双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD,减弱尿苷酰去除酶的活性,增强NH4+的转运和利用,提高L-精氨酸的合成。【方法】本文对来源于谷氨酸棒杆菌的突变菌株JNR中的双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD进行整合突变,采用同源重组的方法将H414和D415位点突变为两个丙氨酸AA,在此菌株的基础上过量表达PII蛋白GlnK,并对其进行尿苷酰化研究,离子色谱检测摇瓶发酵过程中NH4+的浓度,并对最终的改造菌株进行连续流加发酵分析。【结果】该双功能尿苷酰转移/去除酶在谷氨酸棒杆菌中成功进行整合突变,有效减弱了尿苷酰去除酶的活性;同时过表达PII蛋白GlnK,其酰基化程度明显增强。摇瓶发酵结果表明菌株L4消耗NH4+增加,L-精氨酸产量为36.2±1.2 g/L,比对照菌株L3高出22.7%。5-L发酵罐实验结果显示改造菌株L4的L-精氨酸的产量为52.2 g/L,较野生型菌株L0提高了25.3%。【结论】谷氨酸棒杆菌合成L-精氨酸的过程中氮源是必不可少的。减弱GlnD尿苷酰去除酶的活性后,胞内尿苷酰化的GlnK-UMP增加,GlnK-UMP与氮转录调控因子AmtR结合,转运至胞内的NH4+浓度提高,促使L-精氨酸产量显著提高。