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不同供氧水平对L-精氨酸分批发酵过程的影响 被引量:8
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作者 许虹 窦文芳 +3 位作者 许泓瑜 张晓梅 饶志明 许正宏 《化工学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第9期2295-2301,共7页
The effect of different oxygen supply levels by controlling flask capacity on the performance of producing L-arginine using Corynebacterium crenatum SYPA5-5 was investigated in the batch fermentation process.The analy... The effect of different oxygen supply levels by controlling flask capacity on the performance of producing L-arginine using Corynebacterium crenatum SYPA5-5 was investigated in the batch fermentation process.The analysis of fermentation kinetic models and metabolic flux indicated that the hexose monophosphate (HMP) pathway was much more active to produce nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) for bacterial growth at a high oxygen supply level.L-arginine production was also enhanced at a high oxygen supply level because of high glucose consumption.On the other hand,there was more metabolic flux from α-KG to Glu,the precursor of Arg. 展开更多
关键词 L-精氨酸 钝齿棒杆菌 发酵 供氧
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直接利用糖质原料产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌glyA基因序列分析 被引量:5
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作者 林琳 窦文芳 +3 位作者 张晓梅 许泓瑜 许正宏 王正祥 《生物技术通报》 CAS CSCD 2008年第5期176-180,共5页
以能够利用糖质原料产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062glyA基因为研究对象,比较C.glutamicum SYPS-062与C.glutamicum模式菌株ATCC13032的glyA基因的异同。分别以SYPS-062及ATCC13032基因组为模板,利用PCR... 以能够利用糖质原料产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062glyA基因为研究对象,比较C.glutamicum SYPS-062与C.glutamicum模式菌株ATCC13032的glyA基因的异同。分别以SYPS-062及ATCC13032基因组为模板,利用PCR技术获得丝氨酸羟甲基转移酶编码基因glyA。核苷酸序列分析结果表明,来源于SYPS-062和ATCC13032的glyA基因片段全长均为1305bp,编码434个氨基酸,分子量为46.5kD,基因的同源性为99.54%,存在6个核苷酸的差异,引起一个氨基酸残基的突变。将获得的基因分别在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达。酶活测定结果显示,2种不同菌株来源的重组SHMT的比活力稍有差异,说明SYPS-062glyA基因的差异对其表达产物SHMT蛋白构型及功能影响不大。提示对于C.glutamicum SYPS-062能够利用糖质原料产L-丝氨酸的机制解析应进一步从glyA基因的转录水平、翻译水平及胞内SHMT辅酶的供给情况等方面进行深入研究探讨。 展开更多
关键词 L-丝氨酸 谷氨酸棒杆菌 glyA基因 直接发酵
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高产精氨酸的钝齿棒杆菌在高低供氧条件下的差异蛋白质组学初步研究 被引量:5
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作者 陶帅 窦文芳 +3 位作者 张晓梅 许泓瑜 饶志明 许正宏 《化工学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第6期1649-1655,共7页
溶氧水平直接影响钝齿棒杆菌合成精氨酸产量的高低,运用双向电泳结合MALDI-TOF-MS及MS/MS质谱鉴定技术的方法对高低供氧条件下高产精氨酸的钝齿棒杆菌的胞内可溶性蛋白进行分离鉴定。结果表明,钝齿棒杆菌菌体蛋白的等电点主要分布在4-7... 溶氧水平直接影响钝齿棒杆菌合成精氨酸产量的高低,运用双向电泳结合MALDI-TOF-MS及MS/MS质谱鉴定技术的方法对高低供氧条件下高产精氨酸的钝齿棒杆菌的胞内可溶性蛋白进行分离鉴定。结果表明,钝齿棒杆菌菌体蛋白的等电点主要分布在4-7的范围内,采用pH4-7的IPG胶条进行分离,得到了645±12个蛋白点。通过软件比对分析发现,在高低两种供氧条件下存在32个显著差异的蛋白点,成功鉴定出了其中的29个蛋白点,代表了27种差异蛋白。采用数据库检索发现这些蛋白参与不同的代谢途径,包括糖类代谢、氨基酸代谢及能量代谢等。其主要集中在HMP途径、TCA循环和尿素循环。分析结果表明,在高供氧条件下能量代谢水平提高,HMP途径的增强可明显缓解高供氧条件下的氧化压力,同时TCA和尿素循环途径活跃有利于精氨酸的合成。 展开更多
关键词 钝齿棒杆菌 供氧差异 蛋白质组 基质辅助激光解析飞行时间质谱
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重组毕氏酵母中降解hIFN-βHSA蛋白酶的鉴定及其活性控制 被引量:1
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作者 宋一丹 窦文芳 +3 位作者 许泓瑜 金坚 陆茂林 许正宏 《生物加工过程》 CAS CSCD 2008年第5期50-54,共5页
研究了重组毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA表达融合蛋白hIFNβ-HSA过程中产物降解的问题。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-Blotting分析结果表明,发酵液中除了9.0×104的目的融合蛋白hIFNβ-HSA外,同时还出... 研究了重组毕赤酵母KM71/pPIC9K-IFNβ-HSA表达融合蛋白hIFNβ-HSA过程中产物降解的问题。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-Blotting分析结果表明,发酵液中除了9.0×104的目的融合蛋白hIFNβ-HSA外,同时还出现了6.5×104的降解带,进一步结合HPLC分析证实该降解发生在融合蛋白hIFNβ-HSA的HSA区域。在此基础上,采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)活性电泳的方法,确定在融合蛋白hIFNβ-HSA表达的过程中,引起融合蛋白hIFNβ-HSA降解的蛋白酶为蛋白酶B(Proteinase B,PrB)。最后,确定了可以抑制融合蛋白hIFNβ-HSA降解的最佳的蛋白酶抑制剂EDTA,通过在诱导表达阶段添加不同浓度的蛋白酶抑制剂EDTA,使融合蛋白的表达量达到22.18 mg/mL,与空白对照组相比增加了61%。 展开更多
关键词 毕赤酵母 蛋白酶 SDS—PAGE 高效液相色谱 人β干扰素-血清白融合蛋白 抑制剂
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二肽基肽酶Ⅳ抑制剂体外筛选模型的建立及应用 被引量:17
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作者 苗雷 许泓瑜 +2 位作者 雷楗勇 金坚 许正宏 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期411-414,共4页
目的建立二肽基肽酶Ⅳ抑制剂的筛选模型。方法以Gly-Pro-PNA为反应底物,通过发色底物法检测DPPIV的活性,对酶量、底物浓度、最佳温度、pH及反应时间进行了优化。结果确定反应条件为酶量0.5U.L-1、底物浓度0.262μmol·L-1、温度37℃... 目的建立二肽基肽酶Ⅳ抑制剂的筛选模型。方法以Gly-Pro-PNA为反应底物,通过发色底物法检测DPPIV的活性,对酶量、底物浓度、最佳温度、pH及反应时间进行了优化。结果确定反应条件为酶量0.5U.L-1、底物浓度0.262μmol·L-1、温度37℃、pH8.2。在上述反应条件下对多种中药进行了筛选,发现中药水蛭、茯神、密蒙花提取物具有DPPIV抑制作用。结论此方法可作为DPPIV抑制剂的体外筛选模型。 展开更多
关键词 DPPⅣ抑制剂 比色法
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鸡枞菌粉不同组分的体外抗氧化活性研究 被引量:17
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作者 周继平 许泓瑜 《中国野生植物资源》 2008年第5期46-49,共4页
目的:研究鸡枞(Termitomyces albuminosus)菌粉不同组分的体外抗氧化活性。方法:通过分离纯化,鸡枞菌粉中皂甙和多糖被富集于两个不同的组分。以Vc,没食子酸和TBHQ为对照,测定不同组分的还原力、对二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)和超氧阴... 目的:研究鸡枞(Termitomyces albuminosus)菌粉不同组分的体外抗氧化活性。方法:通过分离纯化,鸡枞菌粉中皂甙和多糖被富集于两个不同的组分。以Vc,没食子酸和TBHQ为对照,测定不同组分的还原力、对二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)和超氧阴离子自由基O2-的清除能力,及其对亚油酸过氧化的抑制作用。结果:鸡枞菌粉不同组分均具有一定的抗氧化活性。结论:鸡枞具有较好的抗氧化活性,为开发鸡枞产品提供了理论依据。 展开更多
关键词 鸡枞 抗氧化 深层发酵 多糖 三萜
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鸡枞发酵菌粉中皂苷的大孔树脂分离纯化 被引量:3
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作者 周继平 许泓瑜 《中国野生植物资源》 2008年第6期50-53,共4页
目的:研究大孔吸附树脂纯化鸡枞皂苷的方法。方法:采用分光光度法测定鸡枞皂甙的含量,分别考察了树脂种类、样品液浓度、pH值、吸附流速、洗脱剂浓度对鸡枞皂甙分离纯化的影响。结果:HPD-450树脂最适合鸡枞皂苷的纯化。工艺条件为:... 目的:研究大孔吸附树脂纯化鸡枞皂苷的方法。方法:采用分光光度法测定鸡枞皂甙的含量,分别考察了树脂种类、样品液浓度、pH值、吸附流速、洗脱剂浓度对鸡枞皂甙分离纯化的影响。结果:HPD-450树脂最适合鸡枞皂苷的纯化。工艺条件为:洗脱剂乙醇的体积分数为40%,吸附流速为1-2 mL/min,样品液浓度为2.5-4.0 mg/mL,样品液pH值为5-7。采用HPD-450大孔吸附树脂对鸡枞皂甙进行纯化效果最优。结论:在上述条件下,大孔树脂可用于鸡枞皂甙的分离纯化。 展开更多
关键词 鸡枞 大孔树脂 提取 皂苷 深层培养
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钝齿棒杆菌精氨酸琥珀酸酶编码基因argH的克隆表达及其重组菌发酵产精氨酸研究 被引量:9
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作者 饶志明 徐美娟 +6 位作者 陆元修 周晨 蓝春燕 窦文芳 张晓梅 许泓瑜 许正宏 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期49-55,共7页
钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA是实验室筛选获得的一株高产精氨酸生产菌株。精氨酸琥珀酸酶(AL)是精氨酸合成过程中的最后一个酶,催化底物精氨酸琥珀酸生成产物精氨酸。为进一步提高精氨酸产量,以钝齿棒杆菌基因组为模板,... 钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA是实验室筛选获得的一株高产精氨酸生产菌株。精氨酸琥珀酸酶(AL)是精氨酸合成过程中的最后一个酶,催化底物精氨酸琥珀酸生成产物精氨酸。为进一步提高精氨酸产量,以钝齿棒杆菌基因组为模板,扩增得到其编码基因argH,全长为1434bp,编码476个氨基酸,理论蛋白分子量大小为50.8kDa,其与C.glutamicum ATCC13032比对其同源性为99.4%,相差10bp,3个氨基酸。将其在E.coliBL21(DE3)及C.crenatum SYPA中成功表达。利用载体pET-28a上的6×His·Tag选用Ni柱亲和层析纯化AL,纯化后获得的重组蛋白的比酶活达156.9mU/mg蛋白,总回收率为72.3%,对该酶的部分酶学性质进行了初步研究,并发现产物精氨酸对其具有反馈抑制作用。成功构建钝齿棒杆菌重组穿梭表达质粒pJC1-tac-argH并将其通过电击转化法转入C.crenatum SYPA中,加强其代谢途径中AL蛋白表达量,并对其发酵产精氨酸做了初步分析。结果表明与出发菌株相比,转化子在精氨酸琥珀酸酶酶活增强了66.8%的基础上精氨酸产量达40.9g/L,比出发菌株产量的35.8g/L提高了约14.2%。 展开更多
关键词 L-精氨酸 钝齿棒杆菌 精氨酸琥珀酸酶 酶学性质 发酵
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镇江香醋固态发酵醋醅中微生物总DNA提取方法比较 被引量:19
9
作者 倪峥飞 许伟 +2 位作者 窦文芳 许泓瑜 许正宏 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期119-125,共7页
【目的】为了更加全面地分析我国传统固态发酵过程中微生物群落的多样性和演替情况,本文以镇江香醋固态发酵为例,对比研究了11种不同的总DNA提取法对醋醅中总DNA提取的影响。【方法】使用紫外分光光度计法和荧光定量PCR(Realtime Quanti... 【目的】为了更加全面地分析我国传统固态发酵过程中微生物群落的多样性和演替情况,本文以镇江香醋固态发酵为例,对比研究了11种不同的总DNA提取法对醋醅中总DNA提取的影响。【方法】使用紫外分光光度计法和荧光定量PCR(Realtime Quantitative PCR)测定了不同提取方法得到的醋醅样品总DNA的产量与纯度,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)法对固态发酵中细菌和真菌的多样性进行了分析。【结果】醋醅总DNA得率最高可达93.2±1.5μg/g干醅,细菌总数最高达到1.73×1013 copies.(g干醅)-1,真菌总数最高达到6.49×1012 copies.(g干醅)-1。不同的提取方法对DGGE结果有明显的影响,6种基于SDS裂解的方法所获得的条带较多。【结论】结果表明,液氮研磨+溶菌酶+SDS高盐抽提法(方法3)为最优的醋醅总DNA提取方法。 展开更多
关键词 食醋固态发酵 DNA提取 荧光定量PCR 变性梯度凝胶电泳
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