太湖流域土壤微生物基因组总DNA分离纯化及其质粒文库的初步构建

采用研磨 /冻融和SDS/蛋白酶K热处理以及CTAB处理等理化方法 ,直接从太湖流域土壤样品中抽提得到微生物总基因组DNA .所得粗DNA用透析袋法以及NucleaotrapsuspensionDNA纯化试剂盒进行了纯化 .纯化过的DNA能够满足常用限制性内切酶酶切、细菌 16SrDNA通用引物和随机引物进行PCR扩增的要求 .将所得纯品DNA经过EcoRI部分酶切之后与酶切并脱磷酸的pSK-空载体连接 ,再以大肠杆菌JM10 9为宿主细胞初步构建了土壤微生物基因组文库 .图 6参

基因芯片技术在微生物学研究中的应用

近年来 ,基因芯片技术的诞生使得在一个实验中就可以同时对成千上万个基因进行转录水平的表达和DNA同源性分析成为可能。该项技术已被应用于揭示许多微生物体的转录表达和基因组的差异 ,随着越来越多的微生物基因组全序列测定的完成 ,基因芯片正逐渐成为许多微生物学研究领域中的一项常规技术。归纳了该技术在微生物生理 ,致病性 ,流行病学 ,生态 ,进化 ,代谢工程及发酵优化等研究中的应用。

一株以甘油为底物产二羟丙酮(DHA)微生物菌种的筛选及鉴定

甘油为微生物可利用的理想碳源,从自然界筛选出21株以甘油为唯一碳源产二羟丙酮(DHA)的菌株,经初步发酵测定发酵液中DHA含量,其中菌株6-8DHA产量最高达6.4g/L。对其进行常规生理生化鉴定实验,并结合16SrDNA基因分析,比对结果表明,菌株6-8与Acinetobacter sp.相似性最高,达99.7%,在细菌分类学上属于假单胞菌目莫拉菌科不动杆菌属。将其命名为Acinetobacter sp.6-8。

钝齿棒杆菌精氨酸生物合成相关基因簇argCJBDFR的扩增及序列分析

采用PCR方法扩增钝齿棒杆菌精氨酸生物合成基因簇argCJBDFR,其序列长为6080bp,其中含有argJ、argB、argD、argF和argR5个完整的开放阅读框。序列和结构分析表明这5个结构基因编码的氨基酸序列与谷氨酸棒杆菌的相应基因编码的氨基酸高度同源,同源性分别为92%、95%、96%、97.5%和100%。

布拉氏酵母和鼠李糖乳杆菌发酵对葡萄籽和枸杞功能性的影响

植物发酵提取物(plant fermentation extract,PFE)是重要的生物活性化合物来源。将不同植物与布拉氏酵母和鼠李糖乳杆菌发酵制备PFE,考察对其活性成分和功能性的影响,探讨菌株与植物底物间的相互作用,为制备葡萄籽/枸杞PFE提供借鉴。结果表明,葡萄籽和枸杞能够促进菌株分泌蛋白酶、脂肪酶、β-葡萄糖苷酶,进一步分解和/或转化植物底物提高其总酚、总黄酮、有机酸等活性物质含量,改变挥发性化合物组成,并显著提高其功能性。较未发酵提取物,DPPH自由基清除率提高了0.3~1.0倍,羟自由基清除率提高了0.4~1.6倍,酪氨酸酶抑制活性有显著改善(P<0.05),鼠李糖乳杆菌/枸杞PFE对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径均在16.0 mm以上。综上所述,微生物发酵能够提高植物原料中功能性活性物的提取效率,增强抗氧化活性、酪氨酸酶抑制活性和抑菌活性。同时,发酵菌种和植物原料的特性对PFE特性具有较大影响。

一种快速提取真菌染色体DNA的方法

介绍了一种适用于多种真菌染色体DNA的快速提取方法。该方法用石英砂振荡破壁 ,快速便捷地提取真菌染色体DNA ,提取时间仅用 1～ 2h。作者应用该方法成功地提取了粗糙脉胞菌 (Neurosporacrassa)、米曲霉 (Aspergillusoryzae)、羊肚菌 (Morchellaesculcnta)、酿酒酵母 (Saccharomycescervisae)等 4种不同真菌的染色体DNA ,所提DNA片段均大于2 0kb ,可直接用于限制性内切酶酶切。

红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统

原生质体是研究和建立真菌遗传转化系统的重要工具。为了建立原生质体介导的红曲霉遗传转化系统,考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体形成和再生的影响。将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上30℃培养30～40h收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放。红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适裂解酶和酶解时间分别为:0.3%lysingenzyme、0.1%cellulase和1%snailase的酶组合,30℃作用2.5h;最适渗透压稳定剂是:1mol/LMgSO4。最适合原生质体再生的培养基为含0.6mol/L蔗糖的CM培养基。原生质体液涂布单层再生培养基的方法,再生率最高,菌株M34和N18分别为8.5%和36.4%。在PEG和CaCl2存在下,以潮霉素B为抗生素选择标记,用质粒pBC Hygro和pNL1共转化菌株M34原生质体,每微克DNA可获得100个稳定转化子。

产还原型谷胱甘肽酵母菌的筛选与初步鉴定

从自然界筛选出98株产还原型谷胱甘肽(GSH)的酵母菌,发酵30h,分别测定胞内GSH含量,其中2053#菌株的GSH产量最高。初步发酵实验结果表明,2053#酵母菌株在发酵28h时菌体生物量(细胞干重)达到最大值11.55g/L,而胞内GSH含量在发酵30h时达到最大值49.74mg/L。在常规生理生化方法鉴定的基础上,结合18SrDNA序列分析表明2053#与Candidaparapsilosis(近平滑假丝酵母)的相似性达99.75%,为Candidaparapsilosis的1个亚种。

gsh 1基因的克隆及其在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase)编码基因gsh1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastorisx-33,构建了重组菌P.pastorisx-33(pGAPZA-gsh1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并通过PCR进行了验证.对阳性转化子的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶的酶活是宿主菌的3.0倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42.2mg/L,是宿主菌的1.6倍.

谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因hom的敲除

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)标准菌株ATCC13032染色体为模板,设计引物PCR扩增高丝氨酸脱氢酶编码基因(hom),在hom基因内部插入一段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因(Km),得到基因元件hom::Km;通过电击转化法将hom::Km转入出发菌株替换原菌株的hom,在含卡那霉素的平板上挑取阳性转化子,通过PCR验证得到高丝氨酸脱氢酶缺陷的重组菌。发酵结果表明重组菌C.g-hom::Km-8发酵60h赖氨酸产量达到4.7g/L,是出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032(0.7g/L)的6.7倍。

高效液相色谱测定发酵液中1,3-二羟基丙酮(DHA)方法的建立

建立了简单且准确的测定1,3-二羟基丙酮(DHA)的高效液相色谱(HPLC)方法。以AlltimaC18(5μm,250×4.6mm)为分离柱,5%甲醇水溶液(0.05%H3PO4调pH至3.0),流速为1ml/min,用紫外检测器在200nm处检测DHA。结果测得DHA标准样品的保留时间为6.2min,并测得DHA的线性范围为0.1～10.0g/L,用HPLC法测得以甘油为底物发酵产DHA发酵液中DHA含量为6.2g/L,并证明高效液相色谱法可有效应用于产DHA发酵过程中产物的检测。

产谷胱甘肽重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究

考察了培养基组成及培养条件对重组巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)x-33(pGAPZA-gsh 1)合成谷胱甘肽(GSH)的影响。优化后的培养基组成为:甘油30g/L、蛋白胨40g/L、酵母膏9g/L、半胱氨酸0.36 g/L、KH_2PO_4 3g/L;培养条件为:自然pH、摇床转速200r/min、装液量为30mL/250mL、接种量为10%。在此优化条件下重组酵母的GSH产量是98.5mg/L,为优化前的2.33倍,生物量最大值达到19.6g/L。在5L发酵罐上进行放大实验,发酵结束后GSH产量、重组菌的生物量分别为97.9mg/L,18.7g/L与摇瓶发酵结果基本吻合。

一株降解除草剂膦化麦黄桐(PPT)菌的筛选与鉴定

从喷洒有除草剂的土壤中分离到一株能分解膦化麦黄桐(PPT)的细菌.该菌在以PPT为唯一碳源的培养基上生长,能利用PPT的最高浓度为2. 7g/L.采用常规生理生化鉴定方法,并结合16SrDNA序列分析法对该菌进行鉴定.结果表明,该菌与生癌肠杆菌(Enterobactercancerogenus)序列相似性为99. 3%,在细菌分类学上属于肠杆菌.将它命名为Enterobactersp. PPT.

有效利用木糖的肠道细菌的筛选及转化

以木糖为惟一碳源筛选得到了 32株能利用木糖快速生长的肠道细菌 ,初步鉴定结果表明 ,有效利用木糖的菌株多为肺炎克雷伯氏杆菌 ,其次是大肠杆菌 .选择合适的质粒对其中的 94 7菌株、15 6 9菌株及E .coliJM 10 9进行转化 ,检验转化子中的质粒在无选择压力条件下的传代稳定性 ,结果野生型菌株的转化率均明显低于E .coliJM 10 9,质粒 pET 2 8a在所试验的几株菌中稳定性相对较差 ,pKK2 2 3 3能在 94 7菌株中稳定存在 .

产1，3丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB)的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.

钝齿棒杆菌产精氨酸代谢途径中argB基因的扩增及其序列分析

根据GenBank报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032序列,设计并合成一对引物,获得了全长argB基因片段.将其克隆到pGEM T Easy载体中,经测序鉴定后,以其为DIG标记探针,通过SouthernBlot分析钝齿棒杆菌A.S1.542与谷氨酸棒杆菌ATCC13032,argB基因核苷酸同源性高达99%,氨基酸序列95%相同.

产1,3-丙二醇重组大肠杆菌JM109(pEtac-dha B-tac-yqh D)的构建

在生物柴油的生产过程中,最高可得到约10%的副产物甘油,副产物甘油的去向将成为生物柴油大规模产业化发展所面临的严峻问题。以生物柴油副产物甘油为原料耦合生产1,3-丙二醇,不仅解决了生物柴油副产物甘油的出路问题,同时降低了1,3-丙二醇的生产成本。本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因 yqhD,利用表达载体pEtac串联构建了重组质粒pEtac-dhaB-tac-yqhD,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇重组大肠杆菌JM109(pEtac-dhaB-tac-yqhD),降低了代谢中间产物3-羟基丙醛的积累,提高了1,3-丙二醇的产量。

利用荧光蛋白研究产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD启动子

【目的】克隆产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因CgGPD的启动子(PCggpd),并通过报告基因gfp的差异表达来研究葡萄糖浓度对PCggpd在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的诱导特性。【方法】采用PCR扩增的方法分别从产甘油假丝酵母基因组和pCAMBIA1302载体中克隆出CgGPD的启动序列PCggpd和绿色荧光蛋白基因gfp。将两个基因同时构建到酿酒酵母表达载体pYX212-zeocin中,构建时将绿色荧光蛋白基因gfp置于CgGPD的启动序列下游,获得重组质粒pYX212-zeocin-PCggpd-gfp。通过电击转化酿酒酵母W303-1A。将重组酿酒酵母S.cerevisiae W303-1A-GFP置于不同葡萄糖浓度培养基中进行培养,利用荧光显微技术对其进行荧光检测。【结果】重组酿酒酵母能产生稳定的荧光,当葡萄糖浓度为2%时,重组酿酒酵母在YEPD培养基中产生较弱的荧光,随着葡萄糖浓度的升高,荧光强度有明显的增强。【结论】PCggpd属于环境胁迫诱导型启动子,高浓度的葡萄糖能诱导PCggpd启动绿色荧光蛋白的高水平表达,这对完善产甘油假丝酵母的遗传背景研究,阐明其高产甘油的机理具有重要意义。

一步法产1,3-丙二醇酿酒酵母基因工程菌的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,发酵法生产1,3-PD是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径。本研究在前期工作的基础上,将分别来源于大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的基因片段yqhD和dhaB串联表达,构建重组表达载体pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB;并得到重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303-1A/pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB。该重组菌和对照S.cerevisiae分别以葡萄糖为底物摇瓶发酵72h后,重组酿酒酵母发酵液中1,3-PD含量约为1.5g/L;而对照菌株不产1,3-PD。以上结果表明本研究在国内首次成功构建了直接以葡萄糖为底物发酵生产1,3-PD的酿酒酵母基因工程菌。为进一步将dhaB、yqhD基因导入其他以葡萄糖为底物高产甘油的酵母宿主中表达,获得以葡萄糖为底物一步法发酵高产1,3-丙二醇工程菌打下了坚实的基础。

细胞色素P450酶对拟无枝酸菌转化洛伐他汀的影响

无锡他汀是胆固醇合成途径中限速酶羟甲基戊二酰辅酶A(HMG—CoA)还原酶抑制剂,由洛伐他汀经拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.ST2710)羟基化转化产生,为研究无锡他汀转化过程,本文利用CO差光谱法在摇瓶水平考察了底物浓度、温度、pH值、溶氧等因素对具有羟基化功能的细胞色素P450酶活的变化情况,以及细胞色素P450酶变化对洛伐他汀羟基化过程中的影响。研究表明,细胞色素P450酶可能是Amycolatopsis sp.ST2710转化洛伐他汀为无锡他汀代谢途径的一个关键酶,对洛伐他汀羟基化有重要作用,这为进一步对微生物转化洛伐他汀的研究打下了基础。