太湖流域土壤微生物基因组总DNA分离纯化及其质粒文库的初步构建

采用研磨 /冻融和SDS/蛋白酶K热处理以及CTAB处理等理化方法 ,直接从太湖流域土壤样品中抽提得到微生物总基因组DNA .所得粗DNA用透析袋法以及NucleaotrapsuspensionDNA纯化试剂盒进行了纯化 .纯化过的DNA能够满足常用限制性内切酶酶切、细菌 16SrDNA通用引物和随机引物进行PCR扩增的要求 .将所得纯品DNA经过EcoRI部分酶切之后与酶切并脱磷酸的pSK-空载体连接 ,再以大肠杆菌JM10 9为宿主细胞初步构建了土壤微生物基因组文库 .图 6参

gsh 1基因的克隆及其在巴斯德毕赤氏酵母中的表达

利用PCR技术克隆了来源于Saccharomyces cerevisiae ALJ036的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl-cysteine synthetase)编码基因gsh1,连接多拷贝表达载体pGAPZA,转化Pichia pastorisx-33,构建了重组菌P.pastorisx-33(pGAPZA-gsh1);在高浓度Zeocin平板上筛选多拷贝阳性转化子,并通过PCR进行了验证.对阳性转化子的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶酶活力进行了测定,结果显示,重组酵母的γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶的酶活是宿主菌的3.0倍,在液体YEPD中重组菌GSH的产量为42.2mg/L,是宿主菌的1.6倍.

谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因hom的敲除

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)标准菌株ATCC13032染色体为模板,设计引物PCR扩增高丝氨酸脱氢酶编码基因(hom),在hom基因内部插入一段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因(Km),得到基因元件hom::Km;通过电击转化法将hom::Km转入出发菌株替换原菌株的hom,在含卡那霉素的平板上挑取阳性转化子,通过PCR验证得到高丝氨酸脱氢酶缺陷的重组菌。发酵结果表明重组菌C.g-hom::Km-8发酵60h赖氨酸产量达到4.7g/L,是出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032(0.7g/L)的6.7倍。

产谷胱甘肽重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究

考察了培养基组成及培养条件对重组巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)x-33(pGAPZA-gsh 1)合成谷胱甘肽(GSH)的影响。优化后的培养基组成为:甘油30g/L、蛋白胨40g/L、酵母膏9g/L、半胱氨酸0.36 g/L、KH_2PO_4 3g/L;培养条件为:自然pH、摇床转速200r/min、装液量为30mL/250mL、接种量为10%。在此优化条件下重组酵母的GSH产量是98.5mg/L,为优化前的2.33倍,生物量最大值达到19.6g/L。在5L发酵罐上进行放大实验,发酵结束后GSH产量、重组菌的生物量分别为97.9mg/L,18.7g/L与摇瓶发酵结果基本吻合。

一株降解除草剂膦化麦黄桐(PPT)菌的筛选与鉴定

从喷洒有除草剂的土壤中分离到一株能分解膦化麦黄桐(PPT)的细菌.该菌在以PPT为唯一碳源的培养基上生长,能利用PPT的最高浓度为2. 7g/L.采用常规生理生化鉴定方法,并结合16SrDNA序列分析法对该菌进行鉴定.结果表明,该菌与生癌肠杆菌(Enterobactercancerogenus)序列相似性为99. 3%,在细菌分类学上属于肠杆菌.将它命名为Enterobactersp. PPT.