微生物多糖的生物合成及代谢工程研究进展

综述了微生物多糖的生物合成途径、基因簇结构与功能和代谢工程的研究进展。真菌多糖的合成途径主要包括:前体核苷酸糖(单糖的活化形式)的合成、合成的起始反应、重复单元的延伸、翻转和聚合、多糖的输出。多糖合成过程中涉及大量的基因,大多数基因存在多糖合成基因簇中,随着基因测序技术的发展,大量的多糖合成基因簇被发现和研究。研究表明:通过调控涉及糖核苷酸合成途径的酶水平可提高胞外多糖的产量,而增加多糖合成基因簇基因在微生物中的表达,可产生更高的多糖合成代谢流。

红曲菌利用生物柴油废液生产红曲色素

对生物柴油废液作简单处理,利用红曲菌发酵生物柴油废液中副产物甘油生产红曲色素。通过响应面方法确定最佳发酵培养基为:甘油48.49g/L,蛋白胨3.12g/L,K_2HPO_4·3H_2O2.01g/L,MgSO_40.48g/L,ZnSO_4·7H_2O0.04g/L,MnSO_4·H_2O0.03g/L,玉米浆13mL/L,植物油10mL/L,起始pH为6。发酵结果表明:在接种量6%(v/v),转速140r/min,35℃的条件下发酵培养6d,红曲色素最高产量到达204U/mL。说明用生物柴油废液中的粗甘油为原料生产红曲色素是基本可行的。可望为生物柴油废液的资源化提供一条环境友好型的途径。

γ-谷氨酰基转肽酶(GGT)基因工程菌的构建及其发酵条件的初步研究

利用PCR技术以Bacillus subtilisSYU20016基因组DNA为模板,扩增出1.8kb编码γ-谷氨酰基转肽酶的基因ggt,将其连接到温控表达载体pBV220,得到重组载体pBV220-ggt,重组载体在大肠杆菌JM109中得到表达。SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量大小为65kDa,同核酸序列测定的推导值相符。对含有ggt的基因工程菌进行表达研究表明:发酵培养温度为30℃,pH为7.2,装液量为20ml(250ml锥形瓶)的条件下42℃诱导4h后,重组菌的γ-谷氨酰基转肽酶酶活力达到6U/ml。目前报道的非基因工程菌(枯草芽孢杆菌NX-2)酶活最高仅为3.2U/ml。

人甲状旁腺激素-血清白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

利用重叠PCR技术拼接PTH和HSA基因,并将构建好的融合基因插入到载体pUC19测序后插入表达载体pPIC9K中,在启动子AOXⅠ和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白PTH-HSA。重组质粒pPIC9K/PTH-HSA经SalI线性化后,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到的转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到表达;Westernblot分析表明发酵液上清中表达的融合蛋白PTH-HSA具有HSA的抗原性:用酶标法测定发酵上清中融合蛋白的甲状旁腺激素活性为318IU/ml。

两步发酵过程中有机酸对产1,3丙二醇的影响

考察了基因工程菌两步发酵生产1,3丙二醇过程中,有机酸对发酵过程的影响,并选用了不同的离子交换树脂对甘油发酵液进行处理。发现有机酸,特别是乳酸对1,3丙二醇生产的抑制作用最明显。在使用离子交换树脂处理有机酸的过程中,确定了使用005号离子交换树脂处理效果最好,005号离子交换树脂可除去大部分的有机酸,处理有机酸后的发酵液发酵产1,3丙二醇产量比未处理的发酵液产量提高166%,转化率提高34%。

克氏梭菌和酿酒酵母混合培养提高己酸产量

为了提高克氏梭菌8022产己酸的能力,缩短发酵周期,作者将该株菌与酿酒酵母进行了混合培养,并进一步分析混合培养体系提高己酸产量的机理。研究表明:在用发酵罐对己酸菌进行纯培养时己酸菌产量可达6.35 g/L,与酿酒酵母共培养时,产酸达到7.09 g/L,产酸提高了12.5%,且到达最大产酸的周期缩短了约48 h。相关参数的分析表明,酿酒酵母在共培养过程中主要通过提高乙酸到丁酸的转化速率,从而提高己酸的产量。通过分析溶氧值和微生物生长参数,表明引起这一变化的主要原因是共培养时酿酒酵母的生长提高了共培养体系的厌氧水平,促进丁酸的生成和转化,从而提高了己酸的产量。

盾壳霉抗逆性菌株的筛选

通过测定野生型盾壳霉JN-CM菌株对所选的各种农药和化肥的耐受性,确定草甘膦、吡虫啉和磷肥对盾壳霉具有较大的抑制作用。采用紫外诱变方式分别筛选了对草甘膦、吡虫啉和磷肥具有一定耐受性的突变菌株,分别命名为UV-G(草甘膦抗性)、UV-I(吡虫啉抗性)和UV-P(磷肥抗性)。此3种抗性突变株具有良好的遗传稳定性,同时在生长繁殖能力及侵染相关酶活性方面与野生菌株无明显差异,具有良好的应用潜力。

纤维床反应器在琥珀酸放线杆菌菌种选育中的应用

为提高琥珀酸放线杆菌对琥珀酸盐的耐受性,在微米尺度的黏胶纤维膜载体上固定琥珀酸放线杆菌并构建纤维床反应器,通过菌体对高盐浓度环境的适应性进化,选育出一株耐盐的高产菌株。结果显示,该菌株琥珀酸产量为38.4±3.14 g/L,比初始菌株提高了23.8%;在3 L发酵罐分别对进化前后的菌株进行补料分批发酵产琥珀酸的验证,发现进化后获得的菌株发酵62 h,产琥珀酸86.3 g/L,生产强度1.39 g/(L·h),糖酸转化率78.7%,相比原始菌株,进化后获得的菌株糖酸转化率提高14.2%,琥珀酸生产强度提高24.1%。

土壤中盾壳霉双标记平板计数法的建立及应用

盾壳霉是一种重要的生防菌,其在土壤中的存活数量直接关系到防治病害的效果。然而目前没有对土壤中盾壳霉直接计数的方法,构建一种简单易行的土壤中盾壳霉计数方法对研究盾壳霉在土壤中的存活动态具有重要意义。本研究利用农杆菌转化法构建了潮霉素基因和绿色荧光蛋白基因标记的双标记盾壳霉菌株,并测定转化子的生长速度、产孢量和菌核致腐能力,初步分析了该方法计数土壤盾壳霉的有效性和可行性。结果显示,潮霉素基因和绿色荧光蛋白基因可以稳定地遗传和表达,并且部分转化子生长速度、产孢量和菌核致腐能力与出发盾壳霉菌株JNCM没有显著差异。加入土壤中的盾壳霉转化子可以在含潮霉素(50μg/mL)、氯霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)的PDA平板培养,杂菌得到充分抑制,呈现绿色荧光的盾壳霉转化子被有效检出,检出限达到2×103个/g土。本研究所构建的计数方法能有效检出施入土壤中的盾壳霉并进行活菌计数,可以用于盾壳霉JN-CM产品在土壤中的定殖、生长、繁殖和存活情况的研究。应用双标记平板计数法研究了不同温度、湿度、接种量和添加菌核等条件下盾壳霉JN-CM在土壤中的存活规律。结果显示,在含有核盘菌菌核的土壤中,盾壳霉JN-CM可以通过重寄生维持一段时间(12周)的数量增长,在长达半年左右(24周)的时间里其存活率仍然可以维持在65%左右。在不含菌核的土壤中,在一般土壤温度(10~20℃)范围内,无论土壤水分含量高低,其半年存活率也可以维持在50%左右。因此,可以预测,连续施用盾壳霉JN-CM生防制剂,可以使其数量在土壤中长期维持在一定的水平范围,达到长效防治效果。

新鲜奶油中黄嘌呤氧化酶的纯化及其酶学性质

采用正丁醇处理、硫酸铵沉淀、凝胶过滤层析和阴离子交换层析等分离技术,从新鲜的稀奶油中纯化得到SDS-PAGE电泳纯的黄嘌呤氧化酶,其最终回收率为19.9%,纯化倍数为82.42,酶比活为8.65U/mg。该黄嘌呤氧化酶的相对分子质量约为280kDa,最适作用温度为40℃,在35℃以下比较稳定;最适pH值是8.5,在pH6.5～8.5时较稳定;Zn2+、Fe2+和K+对黄嘌呤氧化酶活性有促进作用,Ag+、Mn2+、Ca2+和SDS对黄嘌呤氧化酶活性有抑制作用。