一株以甘油为底物产二羟丙酮(DHA)微生物菌种的筛选及鉴定

甘油为微生物可利用的理想碳源,从自然界筛选出21株以甘油为唯一碳源产二羟丙酮(DHA)的菌株,经初步发酵测定发酵液中DHA含量,其中菌株6-8DHA产量最高达6.4g/L。对其进行常规生理生化鉴定实验,并结合16SrDNA基因分析,比对结果表明,菌株6-8与Acinetobacter sp.相似性最高,达99.7%,在细菌分类学上属于假单胞菌目莫拉菌科不动杆菌属。将其命名为Acinetobacter sp.6-8。

产1，3丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB)的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,其最重要的用途是作为合成聚酯PTT的单体.由于微生物发酵法生产1,3-PD具有操作简单,不易产生有毒副产物等特点,已得到广泛关注.本研究在前期工作的基础上,分别获得了来源于肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶编码基因dhaB和来源于大肠杆菌的1,3-PD氧化还原酶同工酶编码基因yqhD,利用温控表达载体pBV220串联构建了重组质粒pBV220-yqhD-dhaB,将其转化大肠杆菌得到产1,3-丙二醇温控重组大肠杆菌JM109(pBV220-yqhD-dhaB).该重组菌在LB培养基中,30℃好氧培养12h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4h,测得胞内甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶同工酶的酶活力分别达到260U/mg蛋白和140U/mg蛋白;在含甘油40g/L的发酵培养基中,30℃好氧培养12h至对数生长中期,再经42℃好氧诱导发酵4h,测得发酵液中1,3-PD含量为8.5g/L.这将为进一步构建基因工程菌生产1,3-PD打下坚实的基础.

荧光素酶基因luc在大肠杆菌中表达条件优化

对重组荧光素酶大肠杆菌菌株M15/pQE30-luc进行了表达条件的优化研究。单因素结果表明:在初始pH值7.0,装液量为20%,2%的接种量,终浓度为0.5mmol/L的IPTG,添加10～30mmol/L的Mg2+,摇床转速为200r/min,37℃诱导3.5h酶的表达量最高。正交试验结果表明:初始pH值为7.0,添加40mmol/LMg2+,接种量2%,装液量为20%时表达量最高,比酶活达1.63×108RFU/mg蛋白。

克雷伯氏菌甘油脱氢酶dhaD的克隆表达、纯化及酶学性质研究

以克雷伯氏菌基因组DNA为模板,扩增得到编码甘油脱氢酶(GDH)的基因dhaD,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a(+)上,在E.coliBL21(DE3)中诱导表达,利用表达载体pET-28a(+)上的6.His-Tag标记选用Ni柱亲和层析法纯化表达具有活性的甘油脱氢酶(GDH),纯化后比酶活达到156U/mg,纯化倍数达4.6倍,回收率为67.4%。并初步研究了该酶的酶学性质,酶反应的最适pH为11.0,在pH7.0～12.0范围内稳定;酶反应的最适温度为30℃,稳定范围为25～45℃;酶动力学参数以甘油为底物的Km为0.54 mmol/L,Vmax为0.49μmol/ml·min。