红曲霉不同转化方法的比较

为了研究红曲霉聚酮体途径，考察和比较了4种不同的转化方法以建立有效的红曲霉遗传转化系统。以潮霉素作为抗性筛选标记，pBC-Hygro作为转化载体，用基于原生质体的传统转化和电击转化、基于萌发孢子的电击转化以及REMI技术转化红曲霉。发现基于萌发孢子的电击转化由于转化率极低而不适于红曲霉转化。基于原生质体的传统转化和电击转化尽管每微克DNA分别能获得135个转化子和125个转化子，但因转化子稳定性差也适合红曲霉转化的转化。应用REMI技术，转化率提高约20倍，每微克DNA 2500个转化子，70％～75％的转化子的稳定，非常适合于红曲霉的转化。

REMI介导电转化产甘油假丝酵母

为了分离耐高渗和甘油代谢相关基因,以Zeocin为选择标记,利用REMI技术电转化产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes。考察了7种限制性内切酶对转化的影响,选择HindIII进一步优化了转化的几个条件。结果表明,在OD600≈1.3时收集细胞,在1.5kV电压下,感受态细胞浓度为2.0×109个细胞/mL,100U Hind III时,能获得129个转化子/μgDNA的较高转化率,58%的转化子稳定,表明REMI技术适合于产甘油假丝酵母的转化。

产甘油假丝酵母基因CgZWF片段的克隆与序列分析

以产甘油假丝酵母基因组DNA为模板,通过简并PCR和反向PCR扩增得到了一个长为1 244 bp片段,并将其克隆到pMD18-Tvector。基因序列分析表明,此片段编码的氨基酸序列与Kluyveromyces lactis的G6pdp同源性最高(62.7%),表明已经得到编码葡萄糖6-磷酸脱氢酶的目的基因片段。该研究为阐明磷酸戊糖途径在产甘油假丝酵母耐高渗和甘油高产中的作用奠定了基础。