过表达NADH激酶基因对酿酒酵母乙醇发酵的影响

甘油是酿酒酵母乙醇代谢途径中的主要副产物,降低甘油生成,可以提高乙醇的产率和原料的利用率。以工业酒精酵母单倍体S1(MATa)为研究对象,构建了一个4.5 kb左右的基因敲除突变盒gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR,利用醋酸锂转化法转入S1,得到重组菌S3(gpd2Δ::PGK1PT-POS5-HyBR),使得工业酒精酵母在敲除GPD2的同时整合过表达了NADH激酶基因POS5。结果表明,在150 g/L的葡萄糖摇瓶发酵实验中,重组菌S3在不影响菌株生理特性的条件下,乙醇得率(g ethanol/g glucose)比原始菌株S1提高了8%,甘油得率(g glycerol/g glucose)降低了33.64%。本研究证明过表达NADH激酶基因可降低乙醇发酵中副产物甘油的生成并提高乙醇得率。

重组枯草芽孢杆菌分泌表达缺陷假单胞菌磷酸三酯酶及其发酵优化

磷酸三酯酶(phosphotriesterase, PTE, EC3.1.8.1)能够水解有机磷化合物,但其应用一直受限于酶表达量低的问题.为了获得高效表达的有机磷水解酶,本文构建了PTE基因来源于缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)的重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis WB600),并采用单因素实验和正交实验对培养基进行优化,确定了重组菌产酶的最佳发酵条件,同时检测重组酶对有机磷类化合物的降解作用.结果表明,最优的培养基组成为蔗糖(40 g/L)、酵母膏(40 g/L)、蛋白胨(20 g/L)、磷酸氢二钾(2 g/L)、硫酸锰(1 g/L)、硫酸镁(6 g/L).经测定,该酶4 h内对(5 mg/mL的甲基对硫磷、乐果以及神经毒剂模拟剂甲基磷酸二甲酯(dimethyl methyl phosphonate, DMMP)的降解率分别达到98%, 92%, 73%,且DMMP在12 h内也完全降解.本文实现了PTE的胞外分泌表达,为研制有机磷化合物的酶基消毒剂提供了技术支持.

不同溶氧对谷氨酸棒杆菌代谢的影响

【目的】以谷氨酸棒杆菌为研究对象,分别控制在0、30%、50%3种溶氧水平下进行发酵,分析不同溶氧水平下代谢的变化。【方法】通过检测发酵代谢物中有机酸、氨基酸的含量,以及测定代谢途径中关键酶活性及其编码基因的表达情况来考察不同溶氧水平下物质代谢发生的变化。通过检测胞内还原力和ATP的含量来分析不同溶氧水平对能量代谢产生的影响。【结果】谷氨酸棒杆菌代谢支路受溶氧的影响而发生改变,氨基酸、有机酸的产量也随之改变。特别是在低溶氧(0)情况下,细胞内氧化磷酸化减弱,导致维持生命活动所必需的ATP供应减少,因此细胞通过增强底物水平磷酸化来产生ATP以满足生命活动的需求。在此情况下,胞内NADH得到较多积累,TCA循环代谢流量减小,而转向糖酵解、乙醛酸循环等,并且这个过程伴随多种杂酸包括乳酸、缬氨酸、亮氨酸等的产生,必将影响目的产物的产量。【结论】研究结果对于进一步采取措施优化溶氧的控制策略,提高目的产物的产量具有指导意义。

谷氨酸棒杆菌内源表达元件的筛选

【目的】构建谷氨酸棒杆菌表达元件探测载体,筛选能够启动蛋白表达的序列片段。【方法】基于谷氨酸棒杆菌表达载体p XMJ19,利用Golden Gate新型克隆方法构建表达元件插入位点,使筛选的片段能够与报告基因快速无缝衔接,同时避免残留额外的序列对表达元件效果测试产生可能存在的干扰。对本课题组前期的谷氨酸棒杆菌BZH001高、中、低溶氧条件下的发酵样品转录组数据进行分析,筛选出稳定于高转录水平的6个基因,通过软件预测每个基因的启动子区域和5′UTR区域,两者构成能够启动基因表达的功能性元件,并将其从基因组中克隆出来。以增强型绿色荧光蛋白基因egfp作为报告基因,快速测量出表达元件的效果。【结果】获得5个不同效果的内源性表达元件,最好的元件插入探测载体后在谷氨酸棒杆菌中表达的荧光强度大于3 500 RFU/OD600。【结论】通过结合转录组数据,探测载体能够快速有效筛选表达元件,为将来人们对谷氨酸棒杆菌基因工程改造和生物系统的构建提供更多基础材料。

谷氨酸棒杆菌中选择性σ因子的研究进展

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一种重要的工业微生物,其基因组中包含编码RNA聚合酶的7种sigma(σ)因子基因,除σA外,其余6种属于选择性σ因子。通过σ因子进行基因表达调控是细菌调控网络中的重要组成部分,因此研究σ因子的功能和调控机制将有助于完善谷氨酸棒杆菌基因调控网络,进而有利于工业生产中菌种优化策略的制定。本文主要对谷氨酸棒杆菌中6种选择性σ因子的功能和调控机制做一综述,并且讨论了在研究选择性σ因子调控功能中需要注意的实验设计问题。最后探讨了选择性σ因子在实际应用中的价值及未来需要深入研究的方向,以期能够为谷氨酸棒杆菌调控网络的进一步完善以及选择性σ因子研究的规范化提供一些参考。

五株木糖利用酵母的生理代谢特性

【目的】木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源,筛选具有高抗逆和高效利用木糖能力的菌株对纤维素类可再生资源综合利用具有重大意义。【方法】论文以5株利用木糖的酵母,即树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis,S.stipitis)、Candida tenuis(C.tenuis)、Spathaspora passalidarum(S.passalidarum)、Candida amazonensis(C.amazonensis)和Candida jeffriesii(C.jeffriesii)为研究对象,研究了其对温度、乙醇浓度、渗透压的耐受性,采用杜氏小管实验研究了其对常用碳源和氮源的利用能力,另外通过木糖发酵实验初步研究了被测试酵母在有氧和限氧条件下的木糖发酵性能。【结果】结果表明,S.passalidarum能够耐受44℃左右的高温,对多种碳源和氮源具有较强的利用能力,此外,S.passalidarum在有氧与限氧条件下均能快速代谢木糖,限氧条件下乙醇得率达0.43 g/g。C.amazonensis对纤维二糖具有较强发酵能力,代谢木糖产生木糖醇和少量乙醇,同时该酵母耐受温度在42℃左右。综合比较,其他酵母在实验过程中没有表现出明显优势。【结论】S.passalidarum在纤维素工业化应用中是一株良好的生产候选菌株。此外,C.amazonensis具有较强的木糖醇生产能力,有望成为一株优良的木糖醇生产菌株。

利用内源元件在谷氨酸棒杆菌中分泌表达木聚糖酶

以来自于谷氨酸棒杆菌内源AH6启动子和5′UTR及其前38 bp结合合适的Shine-Dalgarno (SD)序列,构建双顺反子表达载体对木聚糖酶进行表达。为了能够实现分泌表达,选取了来自谷氨酸棒杆菌的两种分泌途径的信号肽,分别为Tat型的CgR0949及Sec型的CspB信号肽。在实现分泌表达之后,对其进行5 L发酵罐的扩大培养以提高分泌量。并对纯化的木聚糖酶进行了部分酶学性质的研究,包括最适催化pH及酸碱耐受性;最适催化温度及热稳定性。结果表明:在上述表达体系中,以CgR0949为信号肽木聚糖酶不能分泌到胞外;木聚糖酶能在CspB信号肽的引导下分泌到胞外,分泌表达量为486.2 U/mL。木聚糖酶的分泌量在5 L发酵罐水平上达到1 648.7 U/mL,是摇瓶培养的3.4倍。该木聚糖酶的最适反应pH为4.5,最适温度为45℃;在pH 4–11范围内4℃处理24 h酶活保持在80%以上;在50℃前处理15 min酶活保持在95%以上,超过60℃则酶活迅速下降至20%及其以下。上述结果表明,谷氨酸棒杆菌内源元件能有效用于木聚糖酶的分泌表达,扩大培养能进一步提升木聚糖酶的分泌量。该双顺反子表达体系能为外源蛋白在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达提供一种可用的工具。此外,通过酶学性质的研究可进一步提高木聚糖酶的催化效率。

Candida amazonensis FLP/FRT基因敲除系统的构建及初步验证

【目的】构建一个适用于Candida amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并通过敲除C.amazonensis的丙酮酸脱羧酶基因(Pyruvate decarboxylase,PDC)对该系统进行初步验证。【方法】以gfpm(绿色荧光蛋白基因)为报告基因,通过添加相应诱导剂评估Spathaspora passalidarum来源启动子(SpXYLp、SpMAL6p、SpMAL1p、SpGAL1p)和Saccharomyces cerevisiae来源Sc GAL1p启动子在C.amazonensis中的诱导调控性能。选择严格诱导型启动子调控FLP重组酶的表达,并在FLP表达盒和潮霉素(Hygromycin B)抗性标记基因(hphm)两端添加同向重复的FRT位点,以PDC基因作为靶基因构建敲除盒PRFg HRP,转化宿主菌C.amazonensis CBS 12363,筛选得到阳性转化子后,通过添加诱导剂,表达FLP重组酶,实现FRT位点间片段切除。【结果】诱导调控实验表明启动子SpGAL1p(受半乳糖诱导)和SpMAL1p(受麦芽糖诱导)是适用于C.amazonensis的严格诱导型启动子。以SpGAL1p调控FLP基因表达,构建的敲除盒PRFg HRP成功转化宿主菌,获得阳性转化子C.amazonensis PDC01,通过添加半乳糖诱导,成功切除基因组中FLP表达盒和抗性标记盒,获得突变株C.amazonensis PDC02。【结论】首次建立了一个适用于C.amazonensis抗性标记可重复使用的FLP/FRT基因敲除系统,并利用该系统成功敲除了C.amazonensis内的PDC基因,为进一步利用代谢工程改造C.amazonensis酵母奠定了良好基础。