重组人ADAM15去整合素区域蛋白与人血清白蛋白融合蛋白的表达及其活性

目的在毕赤酵母中表达重组人ADAM15去整合素区域蛋白(recombinant human disintegrin of ADAM15,rhddADAM15)与人血清白蛋白融合蛋白(HSA-rhddADAM15-His),并测定其活性。方法以rhddADAM15基因为模板,PCR扩增rhddADAM15-His基因,克隆入pBluescript-HSA质粒中,经酶切后与pPIC9k载体连接,构建重组表达质粒pPIC9k-HSA-rhddADAM15-His,将重组表达质粒转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。表达产物经Blue-Sepharose、Ni2+螯合层析及DEAE阴离子交换层析纯化,纯化产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,利用划痕及SRB法检测其活性。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;融合蛋白HSA-rhddADAM15-His相对分子质量约76 000,以可溶性分子形式存在于发酵液上清中;纯化的融合蛋白纯度约为75%,可与兔抗rhddADAM15多克隆抗体特异性结合;融合蛋白对小鼠黑色素瘤细胞B16的迁移具有明显的抑制作用,但对其增殖无明显抑制作用。结论成功在毕赤酵母GS115中表达并纯化了HSA-rhddADAM15-His蛋白,为其作用机理的研究奠定了基础。

重组人ADAM15去整合素区域蛋白抑制肿瘤细胞增殖作用的研究

观察重组人ADAM15去整合素区域蛋白干预肿瘤细胞增殖效应,为研究其作用机制提供基础。采用SRB法筛选重组人ADAM15去整合素区域蛋白敏感肿瘤细胞,分析其剂量依赖关系。利用流式细胞仪分析重组人ADAM15对肿瘤细胞周期的影响,并利用DAPI染色检测其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。重组人ADAM15去整合素区域蛋白对于观察的8种肿瘤细胞的增殖均有明显的抑制作用,其中人宫颈癌细胞Hela及野生型乳腺癌细胞MCF-7最为敏感,IC50分别为2.97,2.90μmol/L,当其浓度低于8μmol/L时,细胞增殖抑制率与蛋白浓度呈剂量依赖关系。选择Hela细胞进行周期检测发现,重组人ADAM15去整合素区域蛋白浓度高于2μmol/L时,Hela细胞周期开始出现S期阻滞,G2/M期含量下降,并出现核凋亡现象。当蛋白干预浓度达6μmol/L时,(53.57±1.43)%的Hela细胞出现凋亡。重组人ADAM15去整合素区域蛋白通过阻滞细胞分裂和诱导凋亡抑制肿瘤细胞的增殖。

rhddADAM15抑制肝癌细胞Bel-7402增殖的作用研究

ADAM15属于跨膜蛋白ADAM家族中的一员,在乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等多种实体瘤中均发现其表达量提高。ADAM15在降解细胞外基质、介导细胞的黏附、细胞间信号转导及在肿瘤发展进程中起到重要作用。因其去整合素区域含有RGD序列,ADAM15可与多种整合素相互作用。在前期工作中,实验组利用大肠杆菌表达系统表达了重组人ADAM15去整合素区域蛋白,记作rhddADAM15。该研究将进一步针对rhddADAM15抑制肝癌细胞Bel-7402增殖的机理进行分析及探讨。SRB法显示,rhddADAM15可抑制Bel-7402细胞增殖并呈剂量依赖性,IC50为1.14μmol/L;利用DAPI核染发现,rhddADAM15可显著诱导Bel-7402细胞凋亡;流式细胞仪分析发现,rhddADAM15浓度为6μmol/L时,(87.44±7.25)%的细胞发生凋亡;PI单染分析细胞周期表明,rhddADAM15作用后,部分Bel-7402细胞周期被阻滞于S期及G2/M期,并呈剂量依赖性,4μmol/L rhddADAM15处理后G0/G1期含量下降约14%;Western blot分析显示,rhddADAM15可下调Bel-7402细胞周期蛋白CDC2的表达,抑制CDC2-Tyr15的去磷酸化,引起G2/M期的阻滞。