草鱼肠道胰蛋白酶同工酶GT-B的纯化及性质

深入了解草鱼消化蛋白酶的性质有利于充分探讨草鱼内脏的可利用途径和研究草鱼消化生理学.将草鱼肠道用冰丙酮脱脂,用磷酸盐缓冲溶液提取,然后经过硫酸铵粗分级沉淀,再经过离子交换层析、凝胶层析等纯化,分离得到一种碱性蛋白酶.SDS-PAGE分析表明其相对分子质量为26400.SDS-底物-PAGE以及抑制实验等表明酶可以水解酪蛋白和N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐(BAEE),其活性被大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)和甲苯磺酰氟(PMSF)强烈抑制,表明这是一种胰蛋白酶,命名为GT-B.用BAEE作底物时,该酶的最适作用温度为45℃,在65℃加热20min,酶活性基本丧失;最适作用pH为8.5,在pH5.5～10.5范围内保持稳定,但在酸性环境里很容易失去活性.该酶的Vmax和Km值分别为3.33×103min-1和31.68μmol·mL-1,其生理转化效率高,为105.26mL·μmol-1·min-1.该酶催化水解合成底物时的活化能Ea比较低,为18.31kJ·mol-1.其活性不受Ca2+的影响,但是Ca2+能提高该酶的热稳定性.Zn2+,Cu2+,Hg2+和Al3+等的存在会使此酶活性降低.

草鱼消化道碱性蛋白酶的分析鉴定

试验结果表明,草鱼肠道粗提取物在pH 10.3有最高酶活力。SDS-底物-PAGE电泳表明,草鱼肠道粗酶中有4种碱性蛋白酶,其中3种是丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶),1种是非丝氨酸蛋白酶,它们的相对分子质量分别为:26 400、30 750、43 000、约105 000。

改进SDS-底物-PAGE技术鉴定淡水鱼消化酶

改进SDS-底物-PAGE技术以用于分析检测淡水鱼中的消化蛋白酶.主要改进了胶浓度、反应温度和时间以及底物蛋白质浓度和处理时间等因素.试验表明:用150 g/L的分离胶,胶片在4℃30 g/L的酪蛋白溶液中浸泡90 min,然后在35℃保温120 min,结合专一的蛋白酶抑制剂,使用SDS-底物-PAGE技术可以检测出草鱼和青鱼肠道中碱性白蛋酶的种类、数量,并推算出它们的分子质量.草鱼肠道中有3种胰蛋白酶,1种非丝氨酸蛋白酶,它们的分子质量分别为:26.4 kDa3、0.75 kDa、40.5 kDa和约105 kDa.青鱼肠道中有2种胰蛋白酶,2种胰凝乳蛋白酶,1种非丝氨酸蛋白酶,它们的分子质量分别为:27.5 kDa、30.1 kDa、40.5 kDa、42.5 kDa和78.5 kDa.