SARS-CoV-2非结构蛋白Nsp2上调A549细胞泛素水平并被泛素化修饰研究

目的 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)因其强大的感染力肆虐全球,因此深入研究病毒与宿主的相互作用是揭示SARS-CoV-2致病机制的重要途经。方法 利用同源重组方法 将SRAS-CoV-2的非结构蛋白Nsp1~Nsp16构建到真核表达载体上,并通过Western blot检测Nsp1~Nsp16重组质粒的蛋白表达情况。接着使用Western blot检测Nsp2对细胞总泛素水平的影响,并通过细胞免疫荧光检测Nsp2在细胞中的分布情况。最后通过免疫共沉淀技术对Nsp2与泛素之间的相互作用关系进行检测。结果 Western blot检测显示Nsp1~Nsp16重组质粒能够在A549细胞中正常表达;筛选发现非结构蛋白Nsp2能在细胞质中上调细胞总泛素表达水平;免疫共沉淀检测进一步发现Nsp2能与泛素蛋白发生相互作用。结论 成功构建了SARS-CoV-2非结构蛋白Nsp1~Nsp16真核细胞表达载体,并发现非结构蛋白Nsp2可以增加细胞总泛素表达水平并被泛素化修饰。提示Nsp2通过泛素途径参与到SARS-CoV-2与宿主的相互作用,有助于深入了解病毒与宿主的作用机制。

黄鹌菜的化学成分及其抗肿瘤活性研究

通过硅胶、ODS、Sephadex LH‑20等多种柱色谱技术以及制备HPLC等对黄鹌菜(Youngia japonica)甲醇提取物进行分离,根据核磁波谱技术对分离的化合物进行结构鉴定。利用MTT法筛选影响三阴性乳腺癌(MDA‑MB‑231)细胞生长的化合物,进一步利用克隆形成实验,Hoechst33342/PI双染色法,Annexin V‑FITC/PI双染以及Western blot检测候选化合物对乳腺癌和结直肠癌的抑制效果及可能的作用机制。从黄鹌菜中分离到5个单体化合物,经核磁共振谱鉴定为grosheimin(1),4(‑3'‑hydroxypropyl)‑2,6‑dimethoxyphnol‑3'‑O⁃β⁃D‑glcoside(2),木犀草素‑7‑O‑β⁃D⁃葡萄糖苷(3),木犀草素‑7‑O‑β⁃D⁃葡萄糖醛酸苷(4),芹菜素(5)。通过活性筛选发现grosheimin能显著降低三阴性乳腺癌细胞MDA‑MB‑231的活力。明视野下观察到在不同浓度grosheimin处理下,MDA‑MB‑231和结直肠癌(HCT‑116)细胞形态发生明显改变;grosheimin作用24 h后,MDA‑MB‑231和HCT‑116的IC50分别为16.86μmol/L、30.94μmol/L。克隆形成实验结果显示,在30μmol/L grosheimin的作用下,MDA‑MB‑231和HCT‑116细胞集落形成能力分别为9%、39.7%;Hoechst33342/PI双染法显示,grosheimin可诱导上述两种细胞的凋亡,且存在浓度依赖性。20μmol/L grosheimin作用24 h后,流式细胞仪检测发现MDA‑MB‑231和HCT‑116的凋亡率分别为45%和37.78%;Western blot检测结果显示随着grosheimin处理浓度的增加,凋亡相关蛋白cleaved PARP水平逐渐增加。以上结果表明,grosheimin可能通过诱导细胞凋亡进而抑制MDA‑MB‑231和HCT‑116的生长。