OpaR对副溶血弧菌pilABCD操纵子的调控研究

目的研究副溶血弧菌群体感应(quorum sensing,QS)系统核心调控子OpaR对pilABCD的转录。方法提取副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和opaR突变株(ΔopaR)的总RNA,采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)研究OpaR对pilA(pilABCD首基因)的转录调控;将pilABCD上游调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒的β-半乳糖苷酶基因上游,构建LacZ重组质粒,并将该重组质粒转入WT和ΔopaR中制备LacZ菌株,通过LacZ报告基因融合试验研究OpaR对pilA的调控以及pilA的时相表达。提取WT株总RNA,采用引物延伸试验研究pilABCD的转录起始位点;PCR扩增pilABCD上游调控区DNA序列,并纯化His-OpaR蛋白,通过凝胶阻滞试验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究His-OpaR与靶DNA片段是否有直接的结合作用,并进一步采用DNaseⅠ足迹试验分析其结合位点。结果qPCR和LacZ报告基因融合试验显示OpaR对pilABCD的转录具有激活作用,pilA的表达水平随培养时间的延长而持续升高;引物延伸结果显示pilABCD只有一个转录起始位点T(-155);EMSA和DNaseⅠ足迹试验结果显示OpaR对位于pilA的翻译起始位点上游-246~-197 bp和-181~-131 bp之间的DNA序列具有结合活性。结论OpaR对pilABCD的转录具有直接的激活活性。