CRISPR-Cas9基因编辑报道系统应用于AAVS1安全港的定点整合

目的利用ZFN与TALEN基因编辑以及同源重组技术将Cas9表达框、基因编辑效率荧光报道系统以及真核细胞筛选标记的DNA超长片段定点插入HEK-293T细胞基因组AAVS1安全港,建立可用于衡量CRISPR-Cas9基因编辑的稳定细胞株。方法利用分子克隆技术构建AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒。利用脂质体将识别并切割AAVS1基因组序列的ZFN和TALEN质粒以及AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒共转染入HEK-293T细胞。使用嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞后,利用杀稻瘟菌素S筛选、红色荧光检测、Cas9 Western blot以及基因组PCR鉴定等方法获得CRISPR-Cas9基因编辑报道系统完整整合入AAVS1安全港的稳定细胞株。继而,将EGFP修复模板单链DNA及EGFP sgRNA瞬时转染入这些稳定细胞株,对失去荧光的EGFP进行基因编辑,恢复其发光功能,并通过荧光检测技术验证基因编辑结果。结果成功获得3株同时具有嘌呤霉素和杀稻瘟菌素S抗性以及表达红色荧光蛋白的单克隆细胞,Western blot证实其成功表达Cas9蛋白,基因组PCR鉴定目的基因成功整合入基因组AAVS1位点。经EGFP基因编辑后,细胞恢复绿色荧光。结论利用ZFN与TALEN将完整的CRISPR-Cas9基因编辑报道系统成功整合入HEK-293T细胞基因组的AAVS1安全港,整合DNA片段长度达11.5 kb,并利用Cas9成功编辑EGFP报道基因。

实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠Th1、Th2和Th17免疫反应检测

目的探讨不同类型免疫反应在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病中的作用。方法 24只SD大鼠随机均分为EAE组和对照组,通过行为观测和大脑微观形态学确认免疫诱导的EAE模型,用ELISA法检测淋巴结和脾细胞培养上清液中IL-4、IFN-γ和血清中IgG水平,流式细胞术检测淋巴结和脾细胞中IL-17及Foxp3细胞频数。结果与对照组相比,EAE组IgG、IFN-γ、IL-17及IL-4水平均明显增高(P<0.05或P<0.01)。结论 Th1、Th2和Th17免疫细胞在EAE的发病均起着重要的作用。