过敏性鼻炎患者外周血CD4^+T细胞表面信号淋巴细胞激活分子的表达

目的:探讨信号淋巴细胞激活分子(signaling lymphocytic activation molecule,SLAM)在过敏性鼻炎患者外周血CD4+T细胞表面的表达及意义。方法:选择18例过敏性鼻炎患者和16例健康体检者,淋巴细胞分离液分离提取外周血单个核细胞,流式细胞术检测CD4+T细胞表面SLAM的表达;同时,采用ELISA法检测血浆中Ig E的表达;分析CD4+T细胞表面SLAM表达与血浆中Ig E表达的相关性。结果:过敏性鼻炎患者外周血CD4+T细胞表面SLAM的表达水平明显低于健康体检者(t=2.29,P<0.05),而Ig E水平明显高于健康体检者(t=2.740,P<0.01);过敏性鼻炎患者血浆中Ig E的表达与CD4+T表面SLAM的表达呈负相关(r=-0.484 8,P<0.05)。结论:过敏性鼻炎患者外周血CD4+T细胞表面SLAM表达降低,在一定程度上可反映疾病的严重程度。

人TSHR289基因重组腺病毒的制备与鉴定

目的:制备腺病毒AdE-GFP-hTSHR289,并进行鉴定。方法:限制性内切酶NotⅠ和XhoⅠ双酶切分别处理p BluescriptⅡSK(+)-h TSHR289和pAdTrack-CMV,回收纯化目的片段hTSHR289,将其插入至线性化的pAdTrackCMV大片段中;限制性内切酶PmeⅠ线性化pAdTrack-hTSHR289与大肠埃希菌BJ5183中pAdEasy-1质粒同源重组,限制性内切酶PacⅠ酶切验证;将阳性重组质粒转染至人胚肾293A细胞,以包装获得表达hTSHR289的腺病毒AdEGFP-hTSHR289;TCID50法检测重组腺病毒滴度。结果:成功地将hTSHR289重组至腺病毒载体,获得携带hTSHR289重组腺病毒载体,包装出携带hTSHR289基因的腺病毒,滴度达3.5×109pfu/m L。结论:制备得到携带h TSHR289的重组腺病毒。

丁酸对小鼠骨髓源树突状细胞的免疫调节作用

目的:观察肠道细菌代谢产物丁酸对体外培养小鼠骨髓源树突状细胞(Bone marrow derived dendritic cells,BMDCs)表型及功能的影响,并探讨其可能的机制。方法:利用丁酸盐对GM-CSF和IL-4体外诱导的BMDCs细胞进行处理,采用流式细胞术检测BMDCs细胞表面分子CD80、CD86、MHCⅡ、B7-DC的表达及其对T细胞增殖的影响;用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测其细胞因子IL-6、IL-12的表达;用格里斯反应(Griess reaction)和免疫印迹法(Western blot)分别检测DC细胞产生NO2-的生成和Toll样受体-4(TLR4)信号通路中ERK分子的磷酸化。结果:丁酸可下调LPS诱导的成熟BMDCs细胞CD80、CD86、MHCⅡ、B7-DC分子的表达。同时,丁酸也可抑制IL-6和IL-12的分泌,并抑制树突状细胞对OVA257-264抗原特异性T细胞的增殖。进一步的Western blot检测结果显示丁酸可抑制DC细胞TLR4信号通路中ERK分子的磷酸化。结论:丁酸可通过抑制DC细胞TLR4信号通路中ERK分子的磷酸化,下调DC细胞的免疫功能。

鲍曼不动杆菌分子特征及其在替加环素压力下外排泵表达的变化

目的鲍曼不动杆菌是医院内感染常见的细菌。文中旨在分析其分子流行特征,检测外排泵和调节蛋白基因的携带率,并研究替加环素对外排泵和调节蛋白基因表达的影响。方法选取2017年5月至2019年3月江苏大学附属医院住院患者183株鲍曼不动杆菌。分为耐药组(一类及以上抗菌药物耐药的菌株,139株),敏感组(药敏试验中的药物均为非耐药的菌株,44株)。应用重复序列PCR作菌株的同源性分析,并以脉冲场凝胶电泳(PFGE)为同源性分析的金标准对部分菌株进行验证和比较。PCR检测耐药相关基因。依据同源性分析、外排泵携带率检测及药敏试验结果,选取6株外排泵基因全携带但耐药表型不同的临床菌株作为实验株,包括敏感株(SAB)、多药耐药株(MDRAB)、广泛耐药株(XDRAB),进行替加环素体外诱导,诱导后的菌株为诱导组,以不含替加环素LB培养的相同菌株为对照组。检测AdeB、TetB等外排泵基因及AdeS、BaeS等调节蛋白的基因表达变化。结果同源性分析显示,183株临床分离株包含有45个克隆群。耐药组AdeB、TetB基因(97.84%、98.56%)检出率均高于敏感组(63.64%、20.45%),CraA、AbeM等基因亦高于敏感组(P<0.05)。替加环素诱导前MDRAB、XDRAB中AdeB(4.17±0.94、6.86±3.23)、TetB(13.06±0.38、13.96±0.63)表达较SAB(0.00±3.70、0.00±0.70)升高(P<0.05),MDRAB菌株中MacB、BaeS表达较SAB菌株亦升高(P<0.05)。MDRAB、XDRAB菌株中AbaQ表达较SAB菌株降低(P<0.05)。诱导组AdeB、TetB在各菌株的表达较对照组明显升高(P<0.01);除SAB1菌株外,AbaQ、AbeM在其余菌株中的表达较对照组明显升高(P<0.05);AdeS在SAB1、SAB2、MDRAB1、XDRAB2菌株中的表达较对照组升高(P<0.05);负调节蛋白SoxR在SAB1、XDRAB1菌株中表达较对照组降低(P<0.05)。结论AdeB、TetB、AbeS、AdeS、BaeS在临床鲍曼不动杆菌多药耐药过程中发挥着重要的作用,其中AdeB和TetB在菌株对替加环素耐药过程中的作用尤为明显,可能是替加环素耐药的优势外排泵基因。

滤泡调节性T细胞在肺癌移植瘤小鼠体内的变化及意义

目的:研究滤泡调节性T细胞(follicular regulatory T cells,Tfr)在肺癌移植瘤小鼠体内的变化,并探讨肿瘤微环境对Tfr细胞的影响。方法:采用皮下注射Lewis肺癌细胞株的方式建立肺癌移植瘤小鼠模型,通过流式细胞术检测小鼠腹壁引流淋巴结和肿瘤组织中Tfr细胞以及CD4+CXCR5+T细胞的比例,分析Tfr/CD4+CXCR5+T细胞比值的变化。结果:肺癌移植瘤小鼠腹壁引流淋巴结中Tfr细胞的比例为(4.13±0.35)%,较正常对照组小鼠[(1.97±0.26)%]明显增加(t=4.985,P<0.01),并且Tfr/CD4+CXCR5+T细胞比值为0.39±0.03,较正常对照组小鼠(0.21±0.02)明显增加(t=5.148,P<0.01)。在肿瘤发展的第14天,肺癌移植瘤小鼠肿瘤组织中Tfr细胞比例增加尤为显著,与第7天相比差异具有统计学意义(t=5.617,P<0.01)。结论:肺癌移植瘤小鼠体内Tfr细胞比例的增加以及Tfr/CD4+CXCR5+T细胞比值的失衡,预示着Tfr细胞可能参与小鼠肺癌移植瘤的发展进程。

GITRL基因SNP-rs2236876分型方法的比较

目的:对3种单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)分型方法进行比较,选择准确有效的SNP分型方法对GITRL SNP-rs2236876A/G进行基因分型。方法:采用Taqman-MGB探针法,限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites,PCR-RFLP)法和直接测序法对GITRL SNPrs2236876A/G进行分型并比较。结果:PCR-RLFP法分型结果直接通过电泳图可见,适合少量的实验对象;TaqmanMGB探针法通过不同的荧光区分不同的基因型,适合大量的实验对象;直接测序法交由测序公司测定,样本数量浮动范围较大,费用较高。结论:Taqman-MGB探针法适用于GITRL基因rs2236876A/G基因分型,PCR-RFLP法适用于基因分型结果的验证,直接测序法适用于鉴定有争议的PCR-RFLP法的验证结果。

环状RNA hsa_circ_0009735对胃癌细胞上皮间质转化、细胞周期和自噬的影响

目的:探讨环状RNA hsa_circ_0009735在胃癌组织和细胞中的表达,阐明其对胃癌细胞上皮间质转化(EMT)、迁移、细胞周期和自噬的影响。方法:取正常胃黏膜GES-1细胞、胃癌MGC-803细胞、MKN-45细胞和HGC-27细胞。将hsa_circ_0009735小干扰RNA和阴性对照转染MGC-803细胞,将胃癌MGC-803细胞分为si-hsa_circ_0009735组和阴性对照组;将对照质粒和hsa_circ_0009735过表达质粒转染入HGC-27细胞,将胃癌HGC-27细胞分为OE-hsa_circ_0009735组和对照质粒组;MGC-803细胞转染细胞自噬质粒pcDNA-eGFP-LC3后分为空白组和不同浓度(0.25、0.50、1.00和2.00 mg·L^(-1))雷帕霉素组。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测胃癌组织和细胞中hsa_circ_0009735表达水平,激光共聚焦显微镜观察各组MGC-803细胞形态表现和细胞中自噬小体数,Transwell小室实验检测各组迁移细胞数,流式细胞术检测不同细胞周期各组细胞百分率,Western blotting法检测各组细胞中微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、微管相关蛋白轻链3Ⅰ(LC3Ⅰ)、E-钙黏蛋白、Cyclin D1、Vimentin和N-钙黏蛋白表达水平。结果:PCR产物经测序发现存在环化位点,与hsa_circ_0009735序列匹配。与癌旁组织比较,胃癌组织中hsa_circ_0009735表达水平升高(P<0.05);与GES-1细胞比较,MGC-803细胞中hsa_circ_0009735表达水平升高(P<0.05)。与空白组比较,0.25和0.50 mg·L^(-1)雷帕霉素组MGC-803细胞形态无明显改变,1.00 mg·L^(-1)雷帕霉素组MGC-803细胞中颗粒增多,边界不清;2.00 mg·L^(-1)雷帕霉素组死亡MGC-803细胞较多。激光共聚焦显微镜下1.00 mg·L^(-1)雷帕霉素组MGC-803细胞中自噬小体数与2.00 mg·L^(-1)雷帕霉素组比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比较,不同浓度雷帕霉素组MGC-803细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05),hsa_circ_0009735表达水平降低(P<0.01)。与阴性对照组比较,si-hsa_circ_0009735组MGC-803细胞中hsa_circ_0009735表达水平降低(P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.01),迁移细胞数减少(P<0.01),G1期细胞百分率升高(P<0.05),S期细胞百分率降低(P<0.01),G2期细胞百分率降低(P<0.05),细胞中Cyclin D1、Vimentin和N-钙黏蛋白表达水平均降低(P<0.05);与对照质粒组比较,OE-hsa_circ-0009735组HGC-27细胞中hsa_circ_0009735表达水平明显升高(P<0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.01),迁移细胞数减少(P<0.01),G1期细胞百分率降低(P<0.01),S期细胞百分率升高(P<0.05),G2期细胞百分率升高(P<0.05),E-钙黏蛋白表达水平降低(P<0.05),Cyclin D1、Vimentin和N-钙黏蛋白表达水平均升高(P<0.05)。结论:胃癌细胞中高表达hsa_circ_0009735可能促进EMT进程,影响细胞迁移和细胞周期,并抑制细胞自噬过程。

荷瘤小鼠MDSCs中TRIM25和PTEN的表达

目的:探讨荷瘤小鼠肿瘤组织来源的髓源抑制性细胞(myeloid derived suppressor cells,MDSCs)中三基序蛋白25(tripartite motif containing 25,TRIM25)和人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten,PTEN)的表达水平及其意义。方法:构建小鼠CT26结肠癌移植瘤模型,采用实时荧光定量PCR(real time fluorescene quantitative PCR,qRT-PCR)技术检测荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs和野生型小鼠脾脏来源MDSCs中TRIM25、PTEN的表达情况。结果:在小鼠CT26结肠癌移植瘤模型中,与野生型小鼠脾脏来源的MDSCs相比,荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中TRIM25表达水平明显升高(P <0. 001),PTEN表达水平显著下降(P <0. 001)。结论:荷瘤小鼠肿瘤组织来源MDSCs中TRIM25的表达升高,PTEN表达下降,提示两者或许参与调控MDSCs。