伤寒沙门菌小RNA T64的功能

目的:探究小RNA T64对伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)表型的影响。方法:用λ-Red重组系统构建小RNA T64的基因缺失变异株,并将携带T64基因序列的重组质粒导入T64缺陷株制备T64回补株,同时将该质粒导入hfq基因缺陷变异株。绘制T64高表达株的生长曲线,观察T64对细菌生长的影响;接种半固体平板观察细菌的动力;结晶紫染色法观察细菌生物膜形成情况。结果:序列分析表明,T64基因缺失变异株构建成功;生长曲线显示,T64高表达促进细菌的生长;与空载体对照株相比,T64高表达株的动力稍减弱;生物膜分析结果显示,T64高表达株生物膜形成能力强于空载体对照株;回补T64基因后,T64缺陷株生物膜形成能力基本恢复,而hfq缺陷株依旧难以形成生物膜。结论:T64能促进细菌生长,且在一定程度上抑制细菌的动力;其有助于S.Typhi形成生物膜,但不足以消除hfq基因缺失对生物膜形成的抑制作用。

副溶血弧菌CalR蛋白的表达纯化及其DNA结合活性分析

目的:原核表达和纯化副溶血弧菌的CalR蛋白并分析其DNA结合活性,为后续深入研究其对靶基因的分子调控机制奠定基础。方法:以副溶血弧菌野生株RIMD2210633基因组DNA为模板,PCR扩增calR的编码区序列,将其克隆入p ET28a中获得重组载体;将重组载体导入大肠埃希菌BL21λDE3中,获得重组蛋白表达菌株,该菌株经IPTG诱导表达His6-CalR,用Ni-柱树脂进行蛋白纯化。PCR扩增T3SS1相关基因exsC、exsD和VP1687的启动子区序列,通过凝胶阻滞实验检测His6-CalR蛋白对它们的结合活性。结果:成功表达纯化出可溶性His6-CalR蛋白;凝胶阻滞实验结果显示,重组蛋白His6-CalR能够直接结合exsC、exsD和VP1687的启动子区。结论:本研究表达纯化的副溶血弧菌CalR蛋白具有DNA结合活性,可用于后续的转录调控机制研究。

非编码RNA AsrH对伤寒沙门菌表型的影响

目的:研究非编码RNA Asr H在伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)中的作用,观察其对应激条件下的生存能力、动力以及生物膜形成等表型的影响。方法:用自杀质粒p GMB151介导的同源重组法,制备asr H基因启动子缺失变异株;绘制生长曲线,观察S.Typhi在酸、氧和高渗应激条件下的生长;用半固体平板培养观察S.Typhi的动力;用结晶紫染色法观察S.Typhi生物膜形成情况。结果:序列分析表明,在变异株asr H基因启动子区域缺失了120 bp;生长曲线显示,与野生株相比,asr H缺陷株在酸性和高渗应激下的生存能力明显降低,而在氧应激下一定时间内升高;asr H缺陷株动力几乎完全消失,而生物膜形成能力强于野生株。结论:Asr H有助于S.Typhi在酸性和高渗应应激环境下生长,对S.Typhi的动力至关重要,且能抑制生物膜的形成。

非编码RNA AsrC对巨噬细胞中伤寒沙门菌生存能力的影响

目的:研究伤寒沙门菌非编码RNA Asr C对其在巨噬细胞中生存能力的影响及机制。方法:用Asr C高表达菌株和空质粒对照株分别感染巨噬细胞12,24 h,检测伤寒沙门菌在感染细胞中的生存能力;qRT-PCR检测asr C、rse C、rpo E mRNA的表达水平;蛋白质印迹检测自噬标志蛋白LC3的表达。结果:与空质粒对照株相比,Asr C高表达菌株感染巨噬细胞12,24 h后在巨噬细胞中的生存能力明显下降(P均<0.01),asr C mRNA表达水平增加(P均<0.05),对侧靶基因rse C mRNA的表达水平增高(P均<0.05),而rpo E mRNA的表达水平无明显变化(P>0.05);Asr C高表达菌株自噬标志蛋白LC3的表达与空质粒对照株间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:伤寒沙门菌非编码RNA Asr C高表达可降低其在巨噬细胞中的生存能力,可能与自噬无直接关系。