医学检验专业卫生理化检验的教学体会

随着人民生活水平不断提高,对环境污染、职业中毒、食物中毒、农药残留等问题严重性的认识逐渐加深,特别是经历了传染性非典型肺炎、禽流感等突发公共卫生事件后,人们逐渐认识到了卫生检验在控制和解决方面的重要作用[1],卫生检验的高等教育亦受到极大关注[2-3]。为了使培养的学生能够更好地适应新世纪社会发展的要求,提高就业率,

免疫纳米荧光碳点技术快速检测乙型副伤寒沙门菌

目的建立一种以新型纳米材料——纳米荧光碳点(carbon dots,CDs)免疫示踪技术快速检测样本中细菌的方法。方法以检测乙型副伤寒沙门菌为例建立方法。用抗沙门菌Ha因子抗体耦联CDs制备成免疫纳米荧光碳点;用抗沙门菌O4因子抗体耦联磁珠粒对样本中乙型副伤寒沙门菌进行富集后,与抗Ha抗体耦联的CDs进行特异性结合,形成抗O4-磁珠粒-细菌-抗Ha-CDs"三明治"式免疫复合物;再用免疫亲和分离液移除复合物中的磁珠粒,借助荧光光谱仪测定分离液中CDs的荧光强度,推算出样品中致病菌的污染情况。结果抗Ha-CDs可有效结合抗O4-磁珠粒富集的细菌,对乙型副伤寒沙门菌的最低检测限为103CFU/mL,总时间约为2 h。结论建立的CDs技术可用于样本中乙型副伤寒沙门菌的快速检测。

磁珠捕获技术在定量液相杂交中的应用

目的 :在建立新的微生物DNA液相定量杂交法的基础上 ,检测了 10株临床分离菌间染色体DNA的杂交率并与固相板法进行比较 ,为该法的推广应用奠定了基础。方法 :根据SYBRGreen1能够特异性结合双股DNA的特性 ,借助链霉亲和素包被磁珠的分离技术和偏振荧光探测方法的敏感性 ,分别捕获和检测游离于杂交液中两种DNA形成的杂交体 ,计算两者间的同源性。结果 :本法测得的 5株肠杆菌科标准菌株和临床分离株种间或科 /属间的杂交率与发表值一致。提示该法可用于各种细菌间的同源性测定 ,且结果稳定、可靠。结论 :偏振荧光法定量测定细菌染色体的同源性 ,具有简便、快速、敏感、特异等优点 ,可以避免微孔板定量杂交法中因DNA脱板所造成的误差 ,便于临床推广应用。

骨髓间充质干细胞和部分肿瘤细胞中Nucleostemin基因的表达

以分离的人胚胎和大鼠骨髓间充质干细胞 (MSCs) ,6种肿瘤细胞株 ,裸鼠肿瘤和转移瘤组织为实验材料 ,以大鼠心肌组织和人胎盘组织为对照 ,探讨nucleostemin基因的表达情况 .RT PCR结果显示 ,nucleostemin基因在MSCs、肿瘤细胞和肿瘤组织中均有不同程度的表达 ,而大鼠心肌和人胎盘组织中无表达 .DNA测序结果证明 ,扩增的PCR产物与GenBank提供的DNA序列完全同源 .SCID裸鼠肿瘤动物模型定量PCR结果证实 ,nucleostemin的mRNA在裸鼠肿瘤组织和转移瘤组织中表达较高 .研究结果表明 ,在细胞中nucleostemin基因不同水平的表达可能与MSCs、肿瘤细胞的增殖和肿瘤的发生、发展与转移有关 .

T-bet、GATA3及相关因子的表达与胃癌及转移的相关性研究

目的:分析胃癌患者Th1和Th2两类细胞因子的基因表达与转录因子T-bet和GATA3表达的相关性,从细胞因子与转录因子角度考证胃癌患者Th1/Th2细胞分化趋势,探讨p53与T-bet的相关性,了解T-bet与肿瘤转移之间的关系。方法:利用荧光定量PCR技术检测55例胃癌患者及45例正常人外周血单个核细胞(PBMC)中T-bet、GATA3转录因子和IFN-γ、IL-4等细胞因子的水平,应用免疫组化法检测胃癌组织中p53的表达状况。结果:55例胃癌患者T-bet、GATA3、IFN-γ、IL-4的表达率依次为51%(28/55)、78%(43/55)、27%(15/55)、69%(38/55)。定量PCR结果显示,病人组的T-bet和IFN-γ明显低于正常对照组(P<0.01),而GATA3和IL-4则明显高于正常对照组(P<0.01)。T-bet与IFN-γ在病人体内的mRNA表达存在正相关性(P<0.01),正常人则没有。GATA3与IL-4的表达在两组中均呈明显正相关(P<0.01和P<0.05),且在p53阳性的患者中,T-bet的表达率较低,而GATA3的表达率较高。结论:胃癌患者有明显Th2漂移现象,且p53的表达与T-bet的表达呈负相关。

MyD88-铜绿假单胞菌表位核酸疫苗的构建及其真核表达

目的:构建重组MyD88基因的铜绿假单胞菌(PA)表位核酸疫苗,并研究其在真核细胞中的表达。方法:将PA的OprF的三个中和性B细胞表位及一个外源通用T细胞表位串联,表位之间用赖氨酸间隔,采用重叠PCR方法合成全基因,并在此序列前插入组织纤溶酶原激活物(tPA)的信号肽基因,将获得的片段与MyD88基因分别克隆到pIRES载体的两个多克隆位点,构建真核双表达重组质粒pIRES-tPA-OprF-MyD88。电穿孔法将pIRES-tPA-OprF-MyD88转入COS-7细胞,通过Westernblot检测其细胞上清tPA-OprF蛋白及细胞内MyD88蛋白的表达。结果:构建的真核表达质粒pIRES-tPA-OprF-MyD88,经电转COS-7细胞后,在其培养的上清液及细胞内检测到目的蛋白。结论:成功构建pIRES-tPA-OprF-MyD88表达载体,并在转染的真核细胞中得以有效地表达,为研究PA预防性疫苗奠定了实验基础。

EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞株SGC7910生物学行为的影响

目的:了解EB病毒BARF1基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响。方法:构建pSG5/BARF1真核表达载体,转染到EB病毒阴性的胃癌细胞系SGC7901,经RT-PCR鉴定,获得BARF1稳定表达的细胞克隆。以pSG5空载体转染细胞为对照,进行细胞凋亡诱导实验、细胞增殖实验、软琼脂集落形成实验和细胞迁移实验。结果:与对照组相比,BARF1表达细胞组经抗癌药顺铂诱导后的细胞凋亡率显著降低(P<0.01),增殖速度显著加快(P<0.01),软琼脂集落形成率显著提高(P<0.05),细胞迁移能力显著增强(P<0.05)。结论:BARF1基因能够全面增强胃癌细胞的肿瘤原性,可能在EB病毒相关胃癌发生与演化的整个过程中起重要作用。

铜绿假单胞菌多表位核酸疫苗的构建及其生物学作用的研究

目的:构建铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)多表位-MyD88基因疫苗并对其免疫原性进行研究。方法:将PA外膜蛋白F(OprF)的三个中和性B细胞表位及一个外源通用T细胞表位串联,采用重叠PCR方法合成DNA,并在此序列前插入组织型纤溶酶原(tPA)的信号肽基因,将此获得的片段与MyD88基因分别克隆入pIRES载体构建重组质粒pIRES-tPA-OprF:MyD88,并将该质粒免疫Balb/c小鼠,采用ELISA法测定特异性抗体水平。气管内接种PA,进行肺组织匀浆PA细菌计数。结果:成功构建真核表达质粒pIRES-tPA-OprF:MyD88,用该质粒免疫小鼠,能刺激机体产生高度特异性抗体,气管接种PA后,免疫组小鼠肺匀浆细菌计数明显低于其他对照组。结论:成功构建了重组有MyD88基因的PA表位核酸疫苗,接种小鼠后可诱导特异性免疫应答,产生较好的抗铜绿假单胞菌感染的免疫保护作用。

胚胎骨髓间质干细胞分离纯化及基本生物学特性

目的 分离纯化胚胎骨髓间质干细胞 (MSCs) ,研究其基本生物学特性。 方法 采用 1 0 73g LFicoll淋巴细胞分离液分离胚胎骨髓MSCs,体外扩增并观察生长特性 ,流式细胞仪检测细胞表面抗原表达和细胞周期 ,染色体技术分析其遗传特性。 结果 胚胎骨髓MSCs培养 3d后呈针尖状的贴壁细胞 ,7～ 10d后细胞融合呈纤维状 ,体外扩增 10代可获得 1× 10 1 2 ～ 5× 10 1 2 个细胞 ;CD13、CD2 9、CD4 4、CD71表达阳性 ,CD3、CD14、CD33、CD34、CD38、CD4 5、HLA DR表达为阴性 ;染色体核型正常 ;G0 G1 期 :84 6 % ,G2 M期 :2 99% ,S期 :12 35 %。 结论 胚胎骨髓MSCs体外具有较好的增殖更新能力 ,在组织工程中可有广阔的应用前景。

多重耐药鲍曼不动杆菌相关耐药基因的分析

目的研究多重耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)的耐药性,并分析其相关耐药基因tetA,tetB,sul1,dfrA,mdfA。方法 2012年8月至2013年3月江苏省镇江市第一人民医院住院患者的痰液标本中分离得到的MDR-AB菌株50株。应用纸片扩散法检测对抗菌药物的敏感度。采用聚合酶链反应(PCR)检测耐药基因tetA,tetB,sul1,dfrA1,mdfA。结果 50株MDRAB对头孢哌酮/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦、米诺环素、复方磺胺甲噁唑的耐药率分别为38%、64%、40%、50%,对其他参与试验的8种常见抗菌药物的耐药率均大于或等于94%。50株MDR-AB中检测到tetB、sul1和mdfA基因的表达,阳性率分别为70%、95%和45%。结论该研究中MDR-AB多重耐药情况比较严重,MDR-AB对四环素、复方磺胺甲噁唑类抗菌药物耐药与tetB、sul1及广谱抗菌药物外排泵基因mdfA等的表达密切相关。

牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的基因克隆、原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:克隆牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB基因、原核表达并制备牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB多克隆抗体。方法:根据牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的DNA序列,设计特异性引物并经PCR扩增其基因。扩增产物经鉴定和测序分析后,与质粒pET-32a(+)重组形成pET-32a-ragB,继而转化大肠埃希菌。IPTG诱导重组蛋白的表达,再通过Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定;获得的重组蛋白行常规家兔免疫,以制备多克隆抗体,并应用ELISA测定抗体效价。结果:PCR扩增获得编码区全长为1506bp可编码501个氨基酸的RagB基因,测序结果与GenBank公布的序列(AJ130872)完全一致;构建了pET-32a-ragB原核表达载体,获得了高表达的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blot表明具有较高的纯度;ELISA结果显示,特异性兔抗RagB的多克隆抗体效价为1×105。结论:在成功构建牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB原核表达载体的基础上,高效表达及纯化了RagB融合蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。为进一步开展牙龈卟啉菌疫苗研究、建立牙龈卟啉菌感染的实验室诊断方法奠定了基础。

二氧化氯对肉制品保鲜的研究

二氧化氯是一种有效的食品保鲜剂 ,目前在水处理、食品加工、保鲜等方面已得到广泛应用。试验研究了不同浓度二氧化氯对酱鸭的保鲜效果及其对酱鸭品质的影响。结果表明 ,酱鸭经浓度为 10 0～ 2 0 0mg/kg的二氧化氯溶液处理 2min后 ,常温下贮存 2 6～ 3 0d仍可保持较好的品质。

小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因腺相关病毒载体的构建

目的:构建小鼠Th1细胞特异性转录因子T-bet基因的腺相关病毒载体。方法:利用RT-PCR方法,从Balb/C小鼠脾细胞的mRNA中扩增T-bet基因全长cDNA,经测序证实后插入Pzac2.1质粒,用磷酸钙沉淀法,与pAddeltaF6及p5E18质粒共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,并通过抽提病毒DNA进行PCR扩增鉴定重组病毒的形成,设立eGFP基因为对照。结果:1592bp的小鼠T-bet基因被成功克隆,分析表明,与Genbank中发表的序列相比具有99.8%的同源性。重组质粒Pzac2.1-T-bet的PCR及酶切鉴定表明T-bet基因被定向插入,与pAddeltaF6及p5E18质粒共转染293细胞包装成病毒后,经荧光显微镜和病毒DNA的PCR检测,证实已完成对重组病毒的包装。结论:成功构建了小鼠T-bet基因的腺相关病毒载体rAAV-T-bet,为免疫紊乱性疾病的T-bet基因干预治疗奠定了基础。

KLF4的生物学功能及其研究进展

Krüppel样因子(Krüppel-like factors,KLFs)家族为锌指蛋白类转录因子,是生物体内一类具有重要功能的蛋白质,参与调控细胞的增殖、分化、胚胎发育等重要生命过程,在细胞分化和细胞周期阻滞中起重要作用。KLF4又称为胃肠富集KLF(gut-enriched Krüppel-like factor,GKLF),是目前研究较多的KLFs家族成员之一。

重组苦瓜叶蛋白MAP30诱导人食管癌细胞株EC-1.71凋亡的实验研究

目的探讨用重组苦瓜蛋白MAP30(Momordica anti-HIV protein of 30 ku)诱导人食管癌细胞株EC-1.71细胞凋亡状况。方法 MAP30诱导EC-1.71细胞后,透射电镜观察细胞凋亡的形态特征;JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位(ΔΨm)变化;ELISA法检测细胞培养上清液中细胞色素c(Cytc)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平;免疫细胞化学法检测细胞ERK1/PERK1,AKT/PAKT和NF-κB表达;荧光微板阅读仪检测细胞caspase-12活性。结果 MAP30诱导可以使EC-1.71细胞固缩,核膜扭曲,核染色质聚集成块并靠近核膜,内质网高度膨胀、扩张;ΔΨm水平下降;Cytc和TNF-α含量增加;胞质中ERK1、AKT表达增强而胞核中PERK1、PAKT表达降低,NF-κB活性降低,caspase-12活性增强。结论 MAP30可以诱导EC-1.71细胞凋亡。

人外周血CD8^+T细胞Runx3的基因克隆及其原核表达

目的:克隆人Runx3基因全长编码区的cDNA,进行鉴定和测序分析,并利用载体pQE30在大肠埃希菌(M15)原核表达人Runx3基因全长序列,为从转录水平探讨Runx3基因与免疫相关性疾病以及肿瘤发生发展的关系奠定基础。方法:MACS分离外周CD8+T细胞;采用RT-PCR方法从人外周血CD8+T细胞获得Runx3基因的cDNA,并连接pMD19-T载体导入大肠埃希菌DH5α,选择阳性克隆,应用M13F/R通用引物进行双向反应测序,以作序列鉴定。利用PCR技术从克隆载体pMD19-T/Runx3获得人Runx3的全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pQE30,形成重组表达质粒pQE30/Runx3;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌M15,测序鉴定后经IPTG30℃诱导4h,SDS-PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白并进行Western blot鉴定。结果:扩增获得的Runx3基因CDS区全长1248bp,编码415个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致。成功构建了原核表达载体pQE30/Runx3,并在工程菌M15中获得大量表达.结论:获得了人Runx3基因的克隆,并成功原核表达和制备出人Runx3融合蛋白。

TLR7/8激动剂及其在肿瘤免疫治疗中的研究进展

0引言TLRs在固有免疫系统中是宿主对抗入侵病原体的第一道屏障。TLRs不但在免疫细胞上有表达,近年来发现,其在肿瘤细胞上也有不同组合的表达。肿瘤细胞上表达的TLRs对肿瘤的发展起着十分重要的作用。

鲍曼不动杆菌的耐药机制及感染防治的研究进展

鲍曼不动杆菌是一类革兰阴性、非发酵、氧化酶阴性的不动杆菌,在自然界分布广泛,在人类主要存在于皮肤表面及呼吸道,是条件致病菌,由于其环境特殊在医院尤其是ICU常呈流行性爆发,是引起医院感染的主要致病菌。近年来,随着鲍曼不动杆菌的分离率和耐药率的不断上升,且呈现多重耐药趋势,研究者及临床医师对该菌的关注越来越密切,

HMGB1在心血管疾病中作用的研究进展

高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1,HMGB1）为高迁移率族蛋白（HMG）家族成员之一,因在聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中能够高迁移能力而得名。广泛表达于多种组织细胞,能够调节基因转录、稳固胞核结构以及释放具有炎症介质功能的核蛋白,