组蛋白乙酰化对A549和BEAS-2B细胞哮喘易感基因ADAM33的影响

目的:研究丁酸钠、曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)及腺病毒E1A相关的300 kD蛋白(adenoviral E1A binding protein of 300 kD,P300)介导的组蛋白乙酰化在人非小细胞肺癌A549细胞及人支气管上皮BEAS-2B细胞中对哮喘易感的解整合素金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)基因表达的影响。方法:将A549细胞及BEAS-2B细胞分别分为丁酸钠对照组(双蒸水处理)和1、2.5、5 mmol/L丁酸钠组,TSA对照组(0.1%二甲基亚砜处理)和0.2、0.4、0.8μmol/L TSA组,按照组别分别予以相应处理;另将BEAS-2B细胞分为对照组(转染P300突变质粒)和P300组(转染P300表达质粒);采用双荧光素酶报告基因法分析ADAM33启动子活性的变化,实时荧光定量PCR(quantitative real time-PCR,qRT-PCR)检测ADAM33 mRNA表达,蛋白质印迹法检测ADAM33蛋白表达。结果:在人非小细胞肺癌A549细胞中,与对照组相比,1 mmol/L丁酸钠组及0.2μmol/L TSA组ADAM33基因启动子活性明显降低(P<0.01);在BEAS-2B细胞中,与对照组相比,1 mmol/L丁酸钠组及0.2μmol/L TSA组ADAM33基因启动子活性、mRNA及蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。加大丁酸钠、TSA药物浓度,ADAM33表达无显著差异。在人支气管上皮BEAS-2B细胞中,与对照组相比,P300组ADAM33启动子活性、mRNA和蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05)。结论:丁酸钠、TSA通过组蛋白乙酰化降低人非小细胞肺癌A549细胞和人支气管上皮BEAS-2B细胞中ADAM33表达,P300通过组蛋白乙酰化降低人支气管上皮BEAS-2B细胞中ADAM33表达。

组蛋白乙酰化抑制哮喘易感基因ADRB2的表达

目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACi)及组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyltransferase,HAT)调控的组蛋白乙酰化修饰对β2肾上腺素受体(β2-drenergic receptor,ADRB2)基因的影响。方法将ADRB2启动子质粒(pADRB2-1918)转染到人正常支气管上皮细胞(BEAS-2B)细胞后,分别加入丁酸钠(sodium butyrate,SoB)和曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA),将pADRB2-1918质粒和腺病毒E1A相关的300kDa蛋白(p300)质粒共转染到BEAS-2B细胞,使BEAS-2B细胞中组蛋白乙酰化,利用双荧光素酶报告基因检测经SoB、TSA及p300处理后BEAS-2B细胞中ADRB2启动子活性。向BEAS-2B细胞中分别加入SoB和TSA,或向BEAS-2B细胞中转染p300质粒,使BEAS-2B细胞中组蛋白乙酰化,利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测BEAS-2B细胞中ADRB2mRNA的相对表达,利用Western blot法检测BEAS-2B细胞中ADRB2蛋白的表达。结果在BEAS-2B细胞中分别加入SoB、TSA和转染p300质粒,参与BEAS-2B细胞中组蛋白乙酰化,发现BEAS-2B细胞中ADRB2启动子活性、mRNA和蛋白的表达均较对照组下降(P<0.05),差异均有统计学意义。结论组蛋白乙酰化可下调哮喘易感基因ADRB2的表达。

转录因子GATA结合蛋白3对哮喘易感基因ADAM33表达的影响

目的:探讨转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)对解整合素金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)基因启动子活性及mRNA表达的影响。方法:以人正常肺上皮BEAS-2B细胞DNA为模板经PCR扩增得到ADAM33基因启动子区1953 bp片段。通过双酶切、连接、转化等步骤将该片段克隆至pGL3-Basic载体构建ADAM33启动子重组质粒,并将其转染至人HEK293T、BEAS-2B细胞中;利用双荧光素酶报告基因技术检测HEK293T、BEAS-2B细胞中所构建的质粒启动子活性。将HEK293T、BEAS-2B细胞分为pcDNA-GATA3组和pcDNA3.1对照组,分别转染GATA3过表达质粒和空白对照质粒,用双荧光素酶报告基因技术检测荧光素酶活性;用实时荧光定量PCR检测BEAS-2B细胞中ADAM33 mRNA相对表达水平。结果:通过PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建含ADAM33启动子片段的重组质粒;重组质粒的ADAM33启动子活性较pGL3-Basic对照组明显增高。与pcDNA3.1组相比,HEK293T、BEAS-2B细胞中pcDNA-GATA3组ADAM33启动子区荧光素酶活性明显增高(P<0.05或P<0.01);BEAS-2B细胞中pcDNA-GATA3组ADAM33 mRNA相对表达水平明显增高(P<0.01)。结论:转录因子GATA3上调哮喘易感基因ADAM33启动子活性及mRNA表达。

自闭症谱系障碍儿童早期筛查外周血生物学标记物研究

目的 研究淀粉样前体蛋白(APP)家族(总sAPP、sAPP-α、sAPP-β)、脑源性神经营养因子(BDNF)及γ-氨基丁酸(GABA)在自闭症谱系障碍与正常儿童外周血水平差异,探讨自闭症早期筛查的生物学标记及其与自闭症严重程度的相关性。方法 选取2019年1—12月在江苏大学附属医院被诊断为自闭症的41名儿童为自闭症组,以同期在该院体检生长发育正常的41名健康儿童为对照组。采用酶联免疫吸附试验检测两组儿童血清总sAPP、sAPP-α、sAPP-β、BDNF及GABA水平。结果 自闭症组儿童血清总sAPP,sAPP-α水平(2 132.98±333.28 ng/mL,335.11±33.87 pg/mL)高于对照组(1 734.76±357.97 ng/mL,274.84±32.12 pg/mL),GABA水平(4.17±0.95μmol/L)低于对照组(6.35±0.84μmol/L),差异均有统计学意义(t值分别为3.92,4.25,-7.27,P值均<0.05);且GABA在重度自闭症患儿外周血水平(3.48±0.77μmol/L)低于轻-中度患儿(4.94±0.98μmol/L),差异有统计学意义(t=-3.31,P<0.05);ROC曲线显示,总sAPP(AUC为0.77,95%CI=0.66~0.87)、sAPP-α(AUC为0.77,95%CI=0.67~0.87)及GABA(AUC为0.95,95%CI=0.90~0.93)具有一定的诊断效能(P值均<0.05),其中GABA曲线下面积最大(0.95),其检测灵敏度(85.65%)及特异性(80.76%)最高。二元Logistic回归分析显示,sAPP-α(OR=1.04,95%CI=1.00~1.07)及GABA(OR=0.02,95%CI=0.00~0.32)表达水平异常是自闭症发生的相关因素(P值均<0.05)。结论 外周血总sAPP、sAPP-α及GABA表达水平在自闭症儿童具有特异性,可以作为疾病筛查的生物学指标,其中GABA敏感度及特异度最高。