重组酶介导的油菜茎基溃疡病菌荧光核酸扩增检测体系的建立

本文通过重组酶介导的核酸扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)建立一种快速检测油菜茎基溃疡病菌的方法。根据油菜茎基溃疡病菌的特异基因LMR1-D保守序列设计引物和探针,分析建立的RAA方法的灵敏度和特异性。该方法在39℃下,反应时间段(<20 min),检测下限可达10拷贝·mL^(-1),与油菜黑胫病菌等近似种无交叉反应,具有良好的特异性。本研究建立的RAA方法反应速度快、特异性强、灵敏度高,适用于油菜茎基溃疡病菌的快速检测。

重组酶介导恒温扩增技术检测疟原虫方法的建立？

本研究利用重组酶介导恒温扩增RAA技术，建立了一种快速检测疟原虫的方法。选取疟原虫18S rDNA序列，设计了检测疟原虫的通用引物，并对引物进行筛选和特异性检测。筛选出4组扩增效果较好的引物。该方法整个反应过程在37℃下进行，扩增时间短（40 min），并具有良好的特异性。结果表明，成功建立了一种检测疟原虫的RAA法，并且该方法适合于进出口岸疟原虫的快速检测。

重组酶介导扩增技术快速检测食品中单核细胞增生李斯特菌

目的建立重组酶介导扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)快速检测单核细胞增生李斯特菌的方法。方法以单核细胞增生李斯特菌的hlyA基因作为靶序列,设计引物和探针,通过构建含目的基因片段的重组质粒,评价RAA方法的灵敏度,通过检测沙门氏菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸、副溶血性弧菌核酸、溶血性链球菌核酸、志贺氏菌核酸基因组DNA,评价其特异性。结果建立的RAA方法可在39℃、20 min内,检测重组质粒中hlyA基因片段,最低可检出的质粒拷贝数为10拷贝/反应,且与沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌、志贺氏菌基因组DNA无交叉反应。结论建立的RAA方法具有灵敏度高和特异性强的特点,可用于单核细胞增生李斯特菌的快速检测。

大豆北方茎溃疡病菌荧光RAA检测方法的建立

本文根据大豆北方茎溃疡病菌与其近似种在序列上的差异,设计了特异性的引物和探针,建立了荧光RAA特异性检测方法,并用大豆上常见的病害及其近似种进行验证。结果表明:供试的菌株,只有大豆北方茎溃疡病菌表现出阳性扩增信号,其他菌株和空白对照均未检测到荧光信号,该方法可以检测到1.0×103 mL^(-1)的阳性DNA,完成整个检测只需20 min左右,可以快速、灵敏的完成进出境大豆产品的大豆北方茎溃疡病菌的检测。

结合重组酶介导的核酸等温扩增和荧光探针快速检测日本血吸虫基因片段

目的结合重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification, RAA)和荧光探针方法建立日本血吸虫特异性基因片段的快速检测方法。方法以日本血吸虫G28 (Sj G28)基因片段作为靶序列,应用DNAMAN 7.0软件设计合成引物及荧光探针,建立荧光RAA反应体系。扩增不同拷贝数的Sj G28重组质粒,评价荧光RAA检测的敏感性;分别以日本血吸虫、曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫基因组为模板进行荧光RAA检测,以评价该方法的特异性。采用荧光RAA分别检测500、 200和50条日本血吸虫尾蚴感染的兔粪中虫卵DNA。分别在50只阴性钉螺中混入1、 2、 3、 4、 5、 10只阳性钉螺,并提取DNA进行荧光RAA检测。结果以不同拷贝数的Sj G28重组质粒为模板进行荧光RAA扩增,在5 min时即可观察到明显的荧光信号,随着拷贝数的不断降低,检测到荧光信号的时间也随之延长,不同拷贝数的扩增均在10 min内完成,最低可检出的质粒浓度为10拷贝/μl。以曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫及华支睾吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。不同数量尾蚴感染的兔粪中提取的DNA样品经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在15 min内完成。含不同数量阳性钉螺的50只阴性钉螺提取的日本血吸虫DNA经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在10 min内完成。结论本研究建立的可检测日本血吸虫核酸片段的荧光RAA方法,反应快捷,敏感性和特异性均较高。

西尼罗病毒的逆转录重组酶介导扩增检测方法

【背景】随着西尼罗热在全球范围内广泛流行,西尼罗热传入我国的风险加大。研究西尼罗病毒的快速检测方法,为西尼罗病毒检测建立方法储备。【目的】建立西尼罗病毒逆转录重组酶介导扩增(reverse transcription recombinase aided amplification,RT-RAA)检测方法。【方法】根据西尼罗病毒基因保守区序列设计引物和探针,建立西尼罗病毒RT-RAA检测方法,并评价该方法的重复性、特异性和灵敏度。【结果】RT-RAA方法的整个扩增反应过程温度恒定,反应温度为39°C,检测时间较短(20 min内),并且检测限可达10 copies,与基孔肯雅病毒、登革病毒、乙型脑炎病毒、黄热病毒等蚊媒病毒无交叉反应,具有良好的特异性,样本检测符合预期。【结论】建立的西尼罗病毒RT-RAA方法具有快速、特异以及灵敏的特点,可用于西尼罗病毒的口岸快速检测和流行病学监测。

甲型流感病毒的逆转录重组酶介导核酸扩增快速检测方法研究

目的利用逆转录重组酶介导核酸扩增技术(RT-RAA)建立检测甲型流感病毒的快速方法。方法通过使用逆转录酶,将甲流病毒RNA逆转录为cDNA,根据NCBI基因库中甲型流感病毒保守序列设计引物及探针,用cDNA作模板,进行RT-RAA检测甲型流感病毒;构建携带甲型流感病毒的质粒,检测已知样本,分析该方法的灵敏度和特异性。结果采用甲型流感病毒通用型引物和探针,能有效扩增出相应病毒的核酸,而对其他非甲流病毒无交叉反应;RT-RAA反应过程均在39℃恒温条件下完成,用时30min即可得到扩增结果,反应体系中最低扩增拷贝数为100copies。结论建立的RT-RAA检测甲型流感病毒方法灵敏度和特异性高,反应快速、操作简单,适用于甲型流感病毒通用型的快速检测。

口腔鳞状细胞癌中CK19表达及其临床意义的Meta分析

目的系统评价CK19（cytokeratin 19,CK19）表达与口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）发生的相关性。方法计算机检索PubMed、EMbase、CJFD、CBM、CNKI、VIP、WanFang Data和The Cochrane Library（2015年第1期）数据库,搜集国内外公开发表的关于口腔鳞癌组织中CK19表达及其与临床病理特征关系的病例-对照研究,检索时限均从建库至2015年1月1日。由2位评价者独立筛选文献、提取资料并评价纳入研究的偏倚风险后,采用RevMan 5.3软件进行Meta分析。结果共纳入文献11篇,其中口腔鳞癌组612例,对照组564例。Meta分析结果显示：CK19在口腔鳞癌组与对照组,口腔鳞癌无淋巴结转移组与淋巴结转移组,高分化组与中、低分化组,临床Ⅰ期组与临床Ⅱ~Ⅲ期组的表达差异均有统计学意义（P≤0.05）;但CK19在口腔鳞癌男性组与女性组,肿瘤大小的T1、T2组与T3、T4组的表达差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论现有证据表明,CK19可能参与了口腔鳞癌的发生、发展、转移过程,与肿瘤的恶性程度呈正相关,可能是预后不良的指征,其可作为口腔鳞癌的分子标志物。

重组酶介导扩增方法快速检测黄热病毒

目的本研究采用重组酶介导的等温核酸扩增方法(RAA),通过使用逆转录酶,建立黄热病毒的一步法等温核酸扩增(RT-RAA)方法。方法根据黄热病毒基因组保守序列设计引物和探针,建立并分析RT-RAA的重复性、特异性、灵敏度;以所建立方法对黄热病毒样本进行检测,同时以基因测序进行验证。结果黄热病毒RT-RAA扩增,体系中加入40 U的逆转录酶扩增效果最佳。该方法检测时间短(<20 min),并且灵敏度高,检测下限可达100 copy,与登革病毒、西尼罗病毒、日本乙型脑炎病毒、基孔肯雅热病毒等蚊媒病毒无交叉反应,具有良好的特异性。结论构建的黄热病毒RT-RAA方法具有快速、特异以及灵敏的特点,适应于黄热病毒的口岸快速检测。

实时荧光重组酶介导核酸扩增在疟原虫快速检测中的应用研究

疟疾是严重危害人类健康的全球性虫媒传染病之一,遍及全球90多个国家和地区,主要分布在热带和亚热带,世界上超过一半的人口生活在疟疾流行区。据统计,疟疾每年感染数千万人,仅在非洲,每年有50万5岁以下儿童死于疟疾,已成为全球最重要的公共卫生问题之一。疟疾的早期诊断和治疗是其防治的关键。

基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的研究

目的利用重组酶介导核酸扩增技术(RAA)建立快速检测呼吸道腺病毒的方法。方法根据NCBI基因库中呼吸道腺病毒hexon基因保守序列设计引物及探针,建立RAA检测方法。构建携带腺病毒hexon基因片段的重组质粒,梯度稀释,评价RAA方法的灵敏性;用建立的RAA方法检测人偏肺病毒、人博卡病毒、呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒,验证方法的特异性。结果用不同拷贝数hexon基因片段的重组质粒进行RAA扩增,在20min内即可得到扩增结果,最低扩增拷贝数为10拷贝/μl;与人偏肺病毒、人博卡病毒、呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒无交叉反应。结论建立的RAA方法灵敏度和特异性高,反应快速、操作简单,适用于呼吸道腺病毒的快速检测。

重组酶介导恒温扩增快速检测人鼻病毒的方法学研究

目的采用反转录重组酶介导核酸扩增技术(reverse transcriptase recombinase aided amplification,RT-RAA)建立检测人鼻病毒的快速方法。方法根据NCBI基因库中人鼻病毒保守序列设计引物及探针,将人鼻病毒RNA反转录为cDNA,然后使用反转录酶,以cDNA作模板,扩增检测人鼻病毒核酸序列。研究采用构建带有人鼻病毒核酸序列的质粒,检测不同浓度的质粒分析该方法的灵敏度,采用已知样本检测方法的特异性。结果设计的人鼻病毒特异性引物和探针,能有效扩增出相应病毒的核酸,而与其他病毒无交叉反应。该反应条件为39℃恒温,扩增结果用时30 min,最低扩增拷贝数为100拷贝。结论建立的RT-RAA检测人鼻病毒方法灵敏度和特异性高,反应快速、操作简单,适用于人鼻病毒的快速检测。

禽流感病毒H5N1的重组酶介导检测方法学研究

采用逆转录-重组酶介导核酸扩增技术(Reverse Transcription Recombinase-aided amplification,RT-RAA)建立检测禽流感病毒H5N1的快速方法。根据禽流感病毒H5N1保守序列设计引物及探针,将H5N1 RNA逆转录为cDNA,然后以cDNA作模板,扩增检测病毒核酸序列。本研究构建了带有H5N1核酸序列的质粒,以此为模板检测不同浓度的质粒,分析该方法的灵敏度,对已知样本进行检测来验证方法的特异性。设计的H5N1特异性引物和探针,能在39℃恒温下,10~30 min可有效扩增出相应病毒的核酸,与其他流感病毒无交叉反应;对质粒的检测灵敏度可达10拷贝。建立的RT-RAA检测禽流感病毒H5N1方法灵敏度和特异性均较高,且该方法操作简单,适用于禽流感病毒H5N1的快速检测。