慢病毒载体的改进及其在血液病基因治疗中的应用

慢病毒载体 (lentiviralvector,LV)具有可感染非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点 ,成为目前较有前途的病毒载体。本文以人类免疫缺陷病毒Ⅰ型 (HIV Ⅰ )为代表 。

Power PICC直型固定法在血液病患者中的应用

目的:探讨Power PICC两种固定方法在导管维护及应用中的效果。方法:将136例PICC置管患者随机等分为对照组与试验组,对照组与试验组均按标准流程常规消毒后待干,对照组按传统方法使导管呈"C"型固定;试验组顺应导管走势,使导管呈直型固定,观察两组患者的PICC穿刺点出血持续时间、导管移位、裂管等情况。结果:试验组患者的穿刺点出血时间短于对照组(P<0.05),并发症发生率差异无统计学意义(P<0.05)。结论:Power PICC直型固定法能明显减少穿刺点出血持续时间,能充分发挥Power PICC在血液病肿瘤患者中的临床应用价值。

急性髓细胞白血病免疫表型分析

目的 分析成人初治急性髓细胞白血病 (AML)髓系抗原、CD34 及Pgp表达特点及其与预后的关系。方法 采用流式细胞仪免疫荧光标记法检测 6 5例初治成人AML的免疫表型。结果 ( 1)髓系抗原阳性率依次为CD33 >CD15>CD13 >CD14 ,CD33 阳性率高达 98.46 %。CD14 在M5、M6表达率较高 ;( 2 )CD34 及HLA DR阳性表达率以M1、M5较高 ,M3 最低 ;( 3)P 糖蛋白 (Pgp)阳性率 5 8.33 % ,Pgp阳性AML的CR率 2 8.5 7% ,明显低于Pgp阴性的CR率 ( 6 3 .6 3 % ,P <0 .0 0 5 )。结论 AML免疫表型检测髓系单抗可选择CD33 、CD15和 (或 )CD14 。CD34 和HLA DR低表达为M3 的特征。

淋系分化抗原在急性髓细胞白血病中的表达及其意义

目的探讨淋系分化抗原在急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）的表达及其临床意义。方法采用ＡＰＡＡＰ法和流式细胞术检测６４例ＡＭＬ的免疫表型。结果９例除表达髓系抗原外尚有淋系抗原表达（Ｌｙ＋ＡＭＬ）。Ｌｙ＋ＡＭＬ组于初诊时肝脾肿大明显，白细胞总数较Ｌｙ－ＡＭＬ组高。用标准方案诱导化疗，其中仅１例部分缓解。结论Ｌｙ＋ＡＭＬ细胞对于常规诱导缓解方案不敏感，选择兼顾ＡＬＬ＋ＡＭＬ的方案可提高治疗效果。Ｌｙ＋ＡＭＬ患者完全缓解（ＣＲ）率低可能与ＣＤ３４和Ｐ１７０过度表达有关。

Castleman病的诊治及误诊分析

目的:提高对Castleman病的诊断和治疗水平。方法报告2例Castleman病,进行分析,为其诊断和鉴别诊断提供一条思路。结果2例均为多中心型,临床呈多部位淋巴结肿大,伴有全身症状及多脏器受累等特征;病理学分型:浆细胞型1例,混合型1例。2例经化疗和生物学治疗后病情稳定。结论Castleman病临床罕见,容易误诊,须与淋巴瘤、浆细胞病等疾病相鉴别。该病诊断主要依靠病理学确定。化疗和生物学治疗可以控制病情发展。

非程控降温—80℃冷冻保存外周血干细胞及应用研究

目的 为外周血造血干细胞（PBSC）的冷冻保存建立简便，经济且有效的方法并应用于临床。方法 采用6．25％二甲基亚砜（DMSO）加7．5％右旋糖酐（DEX）为冷冻保护剂，将21例恶性血液病患者行干细胞动员，采集获取的PBSC浓集液与细胞冻存液混合，不同程控降温而直接将分装后的混悬液和小样本保存于－80℃冰箱中。于冻存前和冻存后1周，1个，3个月和6个月时分别取样分析，检测细胞回收率和台盼蓝拒梁率。结果 冻存1周和1个月其细胞回收率和存活率无明显差别（P＞0．05），冻存至3个月时细胞活性及CD34^+细胞回收率明显降低（P＜0．01），但不随同存期延长而进行性下降。19例移植患者输注保存后的PBSC均获得造血重建。结论 非程控－80℃冷冻技术是一种简便，经济和有效的造血干细胞冻存方法，且能很好地保存PBSC的造血潜能。

特发性血小板减少性紫癜的护理体会

目的:本文通过回顾性分析56例特发性血小板减少性紫癜患者的临床资料,阐述了本病的心理护理、病情观察、出血的护理、用药护理、饮食护理、健康教育等护理措施。对特发性血小板减少性紫癜患者采取综合性的护理干预措施,可以有效地提高临床治疗效果,降低并发症的发生率,降低死亡率。

血液成分单采术在血液病中的应用及不良反应的观察

目的 初步探讨血液成分单采术在血液病治疗中的应用并观察其不良反应.方法 对524例患者应用CS-3000 plus血细胞分离机进行916次治疗性血液成分单采,根据病人情况选择不同细胞收集程序,分析临床效果和实验室指标的改善情况,并分析其不良反应及处理措施.结果 行血细胞单采术后210例高白细胞患者白细胞由（230.1±48.5）×10^9/L降至（49.3±10.0）×10^9/L;123例真性红细胞患者血红蛋向由（216.0±23.0）g/L降至（150.0±12.0）g/L,红细胞由（7.1±0.5）×10^12/L降至（4.3±O.8）×10^12/L;158例高血小板患者血小板由（1 080.0±314.0）×10^9/L降至（341.0±82.0）×10^9/L,治疗前后差异均有统计学意义（P〈0.01）.32例血栓性血小板减少性紫癜患者行血浆置换后,90.6%患者临床症状、体征及实验室指标均明显改善.少部分患者出现枸橼酸盐中毒（3.0%）、低血容量休克（0.7%）、过敏反应（4.6%）等不良反应,经对症处理后均得以缓解.结论 利用血细胞分离机进行治疗性血液成分单采术和血浆置换术可迅速缓解临床症状,减少并发症的发生,疗效肯定且安全可靠,不良反应少,并对提高临床药物治疗效果有很大意义.

黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤易位蛋白功能及其在血液肿瘤中对核因子-κB信号通路的调节作用

在机体适应性免疫反应中，黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤易位蛋白（MALT）1是抗原诱导的核因子-κB信号通路激活的关键因子，其蛋白酶活性的激活可增强机体免疫反应。近年来，相关研究结果表明，MALT1的蛋白酶活性对MALT1依赖性淋巴瘤[活化B细胞样亚型弥漫大B细胞淋巴瘤（ABC—DLBCL）与MALT淋巴瘤]细胞生存及增殖是必需的；亦有文献报道，MALT1与急性T淋巴细胞白血病（T—ALL）、急性B淋巴细胞白血病（KALL）的发生相关，且在骨髓瘤细胞株中过表达。笔者拟就MALT1的功能、对核因子-κB信号通路的调节作用及其与血液系统肿瘤的关系进行综述。

伴t（9；22；22）（q34；q11．2,q13）复杂易位的慢性髓细胞性白血病一例

患者男,38岁,既往体健，因“消瘦乏力半年”于2014年1月9日入院。人院后血常规提示白细胞226．6×109／L，血小板208×109／L，血红蛋白76g／L[血常规正常值参考范围：白细胞（4～9）×109／L，血小板（100～300）×109／L，血红蛋白120～160g／L]。查体：中度贫血貌，胸骨无压痛，巨脾（脾脏Ⅰ线18cm，Ⅱ线20cm，Ⅲ线＋6cm）。

急性髓细胞白血病基因突变研究现状及展望

急性髓细胞白血病（AML）是一组高度异质性的克隆性疾患，具有独特的细胞形态学、免疫表型、细胞遗传学及分子遗传学特征。一些重现性基因突变已被证实是AML诊断分型、危险分层及评估预后的重要因素，并且一些针对突变基因的特异性靶向药物也逐渐进入临床研究。笔者根据目前AML的相关研究进展，对一些与AML预后相关的基因突变进行总结，旨在为理解和探索AML的发病机制拓宽思路。

多发性骨髓瘤的分层及微小残留病检测

多发性骨髓瘤（MM）是血液肿瘤中一类常见的恶性疾病，发病率居血液肿瘤第2位，其发病率在我国逐年上升，且发病趋势呈年轻化，严重影响患者的生存时间和生活质量。近年来，随着对MM研究的深入，使MM患者的无进展生存（PFS）和总体生存（OS）期均明显提高，但目前仍不能从根本上治愈该病。对于存在高度异质性的MM，基于预后分层进行规范化、精准化治疗及应用高灵敏度的技术手段检测微小残留病（MRD）是治疗该病主要的发展趋势。

逆转录病毒与慢病毒介导HSV-TK/GCV防治移植物抗宿主病的比较研究

移植物抗宿主病（GVHD）是限制异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）临床应用的最主要并发症，现有的防治方法均不理想，应用自杀基因系统防治GVHD是一个新的尝试。本实验将携带单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因的逆转录病毒和慢病毒分别感染供鼠（C57BL／6小鼠）脾细胞，感染后细胞与供鼠骨髓细胞混合移植到经Co^60γ射线照射后的受鼠（BABL/C小鼠），移植后分别给受鼠腹腔注射更昔洛韦（GCV），初步观察HSV-TK／GCV系统控制GVHD的效果，并在体内外实验中对两种载体进行比较研究。

一例伴有t(1;18)(p31;p11)易位的骨髓增生异常综合征

目的报告一例伴有t(1;18)(p31;p11)的骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndrome,MDS)。方法骨髓细胞24h培养后按常规方法制备染色体,采用R显带技术进行染色体核型分析;以1号和18号整条染色体涂染探针对其进行染色体涂染检测。结果常规细胞遗传学方法和染色体涂染分析均证实该患者具有t(1;18)(p31;p11)克隆性染色体异常。结论t(1;18)(p31;p11)易位是一种罕见的再现性染色体核型异常,在MDS中属于首次报道。

AATF-Che1超家族基因原核表达及其融合蛋白纯化

目的 体外构建抗凋亡转录因子（AATF）-Che1重组蛋白原核表达载体pGEx-4T-1-AATF-Che1,优化pGEX-4T-1-AATF-Che1重组载体原核诱导表达条件,并获得可溶性的纯化谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白.方法 采用聚合酶链反应（PCR）法从pGEX-4T-1-AATF重组质粒扩增出AATF-Che1基因,将其与原核表达载体pGEX-4T-1双酶切后,回收目的基因片段.通过T4连接酶定向连接AATF-Che1基因和线性化原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组蛋白AATF-Che1原核表达质粒pGEX-4T-1-AATF-Che1.将构建正确的表达质粒转化入大肠埃希菌感受态细胞BL21,并采用诱导剂异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白AATF-Che1的表达.考察不同诱导剂IPTG浓度、诱导时间和诱导温度对重组蛋白表达量及表达方式的影响,从而对诱导条件进行优化.采用谷胱甘肽琼脂糖凝胶珠对可溶形式的GST融合蛋白进行纯化,并采用Western蛋白免疫印记（WB）法鉴定获得的纯化蛋白.结果 原核表达质粒pGEX-4T-1-AATF-Che1的酶切、PCR鉴定结果及测序结果均正确;IPTG诱导蛋白在约65 kD处出现了1条新的蛋白条带,即AATF-Che1与GST的融合蛋白.不同的诱导时间及不同的IPTG浓度条件下,诱导融合蛋白的量均未见明显变化;37℃诱导时,重组蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中,而16℃诱导时,融合蛋白可溶性地存在于上清液中.最终成功获得AATF-Che1可溶性纯化的融合蛋白,且WB法鉴定其抗原性良好.结论 体外成功构建AATF-Che1基因重组蛋白原核表达载体pGEX-4T-1-AATF-Che1,寻找到优化的重组载体原核诱导表达条件,并获得了大量可溶形式纯化的GST融合蛋白,为进一步研究AATF-Che1超家族基因在肿瘤中的作用奠定了基础.

移植物抗宿主病生物学标志物的研究进展

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是某些血液系统肿瘤和部分自身免疫缺陷性疾病唯一有效的治疗手段。然而，移植物抗宿主病（GVHD）是allo-HSCT后最常见并发症之一，也是移植相关死亡的主要原因之一。目前，临床尚缺乏有效预测allo-HSCT后发生GVHD的生物学标志物。笔者从主要组织相容性复合物（MHC）、非人类白细胞抗原（HLA）基因多态性、微小RNA（MiRNA）、细胞生物学标志物、细胞因子、病理学标志物方面，对可能作为预测GVHD发生的生物学标志物进行综述。

PGK驱动逆转录病毒载体介导HSV-TK／GCV控制GVHD的研究

目的：研究磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子驱动的逆转录病毒载体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSV-TK／GCV）系统在小鼠异基因骨髓移植（allo-BMT）后能否减轻移植物抗宿主病（GVHD）。方法：将转HSV-TK基因的逆转录病毒感染供鼠（C57BL/6鼠）脾淋巴细胞，感染后细胞与供鼠骨髓细胞混合移植给Coγ7射线照射后的受鼠（BALB／c鼠）。移植后腹腔注射GCV，用药1周，按移植后首次给药时间，分为GCV0d组、GCV7d组、GCV12d组。观察移植后受鼠生存期、存活率、GVHD发生率及严重程度、T细胞免疫重建（CD3、CD4、CD8）及异基因嵌合等指标。结果：TK／GCV0d组、TK／GCV7d组小鼠平均生存时间分别为（26.90±4.88）d、（27.00±4.80）d，较TK／GCV12d组（21.504±3.26）d和移植对照组（15.10±O.43）d明显延长（P〈0.05），TK／GCV0d组与TK／GCV7d组之间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。对照组小鼠12～14d100％发生Ⅲ～Ⅳ级GVHD，实验组死亡小鼠有Ⅱ～Ⅳ级GVHD病理学改变，而长期生存小鼠仅出现Ⅰ～Ⅱ级GVHD。TK／GCV0d组、TK/Gcv7d组、TK／GCV12d组在移植后5、10、15d3个时间点检测CD4^＋ T细胞均高于对照组（P〈0.05），CD8^＋ T细胞均低于对照组（P〈0.05）。移植后30d检测10只受鼠异基因嵌合率均在95％～100％。结论：PGK启动子驱动的逆转录病毒载体介导HSV-TK／GCV系统能有效控制小鼠allo-BMT后GVHD，移植后早期预防性用药效果优于发生GVHD后治疗性用药。

^60Coγ射线致死剂量全身照射对小鼠脾脏和肠系膜淋巴结T细胞亚群表面免疫分子表达水平的影响

目的探讨小鼠接受^60Coγ射线致死剂量全身照射（TBI）后，脾脏和肠系膜淋巴结T细胞活化分子和黏附分子表达水平的变化。方法于2012年7月至10月，选择12只无特定病原体（SPF）级雄性BALB／c小鼠为研究对象。研究对象纳入标准：周龄为10～12周龄，体重为20-25g。按照完全随机法将其分为TBI组（接受致死剂量TBI）和对照组（未照射），每组6只。TBI组予^60Coγ放射源一次性照射（剂量率为0．66Gy／min，总剂量为7．5Gy）。于照射后第7天，脊椎离断处死两组小鼠，无菌条件下，取其脾脏、肠系膜淋巴结，研磨后采用密度梯度离心法收集单个核细胞。采用流式细胞术检测两组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中，CD4^＋T，CD8^＋T，辅助性T细胞（Th）1及细胞毒性T细胞（Tc）1细胞表面CD44和CD62L的表达水平。并采用统计学方法比较两组小鼠上述免疫分子表达水平。结果照射后第7天，TBI组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结CD44^＋CD4^＋T细胞比例为（88．1±1．1）％和（76．7±1．8）%，均低于对照组的（95．0±1．1）％和（92．8±1．4）％，且差异有统计学意义（t=-11．01、-17．82，P〈0．05）；而CD44^＋CD8^＋T细胞的比例分别为（99．0±0．3）和（92．5±1．7）％，均高于对照组的（88．7±0．8）％和（83．4±1．6）％，差异亦有统计学意义（t=31．15、9．54，P〈0．05）。TBI组小鼠肠系膜淋巴结CD44^＋Thl比例为（4．1±0．4）％，高于对照组的（1．0士0．2）O，且差异有统计学意义（t=14．78，P〈0．05）；而两组小鼠脾脏CD44^＋Th1比例比较，差异无统计学意义（t=-0．93，P〉0．05）。TBI组小鼠脾脏和肠系膜淋巴结CD44^＋Tc1比例分别为（65．5士4．6）O和（26．6±2．8）％，较对照组的（41．8±1．5）％和（18．7±1．3）％增高，且差异有统计学意义（t=9．97、6．51，P〈0．05）。TBI组小鼠的脾脏和肠系膜淋巴结中的CD4’T和CD8^＋T细胞表面CD62L的表达水平均低于对照组，脾脏中表达水平分别为（0．3±0．0）％比（66．7±4．7）％，（1．1±0．2）％比（64．4±5．1）%；肠系膜淋巴结中为（2．6±0．3）％比（89．7±2．8）％，（9．1士0．5）％比（79．4±3．3）%，两组上述4项指标比较，差异均有统计学意义（t=24．52、-21．53、-53．75、-36．56，P〈0．05）。结论小鼠接受TBI后，脾脏和肠系膜淋巴结的T细胞被激活，表现为活化分子CD44在效应T细胞表达升高，而黏附分子CD62L表达下调，T细胞表型改变。通过检测T细胞表面CD44、CD62L等活化及黏附分子的表达水平，可在一定程度上反映体内T细胞活化情况，为评估TBI预处理方案应用后，机体T细胞功能状态的改变提供依据。

免疫球蛋白轻链型淀粉样变性的诊疗进展

免疫球蛋白轻链型淀粉样变性（AL）为最常见的系统性淀粉样变性，其特征为单克隆免疫球蛋白轻链的错误折叠引起的淀粉样蛋白的沉积。AL发病机制与多发性骨髓瘤（MM）相关，可继发于MM。目前，诊断延误仍然为影响AL疗效的最主要因素。因此，早期诊断及治疗对改善AL患者的预后具有重要意义。笔者拟就AL诊断、治疗及预后进行综述。