数理统计在胰岛素类似物生物活性测定中的应用

创新实验大学生利用数理统计学的相关知识,按照《中国药典》2010年版附录Ⅻ中的要求,测定胰岛素类似物的生物活性。通过交叉设计的方差分析及假设检验,评判胰岛素标准品与胰岛素类似物供试品引起小鼠血糖下降的作用,对实验中同批小鼠的给药时间间隔、胰岛素类似物母液储备时间进行探索,并计算胰岛素类似物的效价。创新实验大学生通过此次胰岛素类似物生物活性测定实验增强实验技能,合理利用数理统计解决了实际问题,并培养了严谨求实的科学态度。

重组猪胰蛋白酶突变体基因在大肠杆菌中的克隆、表达与活性分析

胰蛋白酶是肽链内切酶,专一性水解多肽链中赖氨酸和精氨酸羧基端形成的肽键。胰蛋白酶切割胰岛素原生成胰岛素,在胰岛素的生产中发挥着重要作用,但由于胰蛋白酶对赖氨酸和精氨酸的切割选择性差别不大,会在切割反应中产生副产物。所以研究开发对底物切割选择性增强的胰蛋白酶,减少胰岛素生产过程中副产物的产生具有较高的应用价值。以猪源胰蛋白酶原基因为模板,通过重叠延伸产生特异位点突变的方法扩增突变胰蛋白酶原(Tg M)基因,该基因编码猪胰蛋白酶的Ser172Ala突变体。将Tg M基因插入到表达载体p ET28a中,转化E.coli DH5α,利用卡那霉素抗性筛选出构建成功的重组质粒p ET28a-Tg M并将其转化E.coli BL21(DE3),构建含Tg M基因的工程菌株并诱导表达。14%SDS-PAGE显示,重组菌经乳糖诱导后表达了目的蛋白,并以包涵体形式存在。包涵体经尿素裂解液变性后,通过稀释法复性,复性液超滤处理并用胰蛋白酶切割,经DEAE-FF离子交换层析分离纯化。纯化蛋白经SDS-PAGE分析,结果表明与胰蛋白酶条带位置相同;用紫外分光光度法检测酶活力,测得突变胰蛋白酶的酶活力为1 300 U/m L,比活力为1 566.27 U/mg。将最终纯化获得的突变胰蛋白酶用于胰岛素原的切割,HPLC检测分析结果表明,突变胰蛋白酶对底物中Arg的切割选择性大于Lys,因此在对胰岛素原的切割反应中,副产物的量明显减少。

重组猪源胰蛋白酶原的构建、表达与活性分析

目的:构建、表达重组猪源胰蛋白酶原,并对其进行分离纯化和酶活性分析。方法:利用大肠埃希菌表达系统(p ET-28a,宿主菌BL21DE3)优化天然猪源胰蛋白酶原基因,经乳糖诱导表达重组胰蛋白酶原蛋白,采用阴离子交换色谱法分离纯化,以SDS-PAGE电泳鉴定目标蛋白,以紫外分光光度法检测重组蛋白的酶活力。结果:测序结果表明,重组猪源胰蛋白酶原基因工程菌构建成功,SDS-PAGE检测显示目的蛋白条带位置与标准猪源胰蛋白酶条带位置一致,且酶活力可达513.09U·mg-1。结论:成功获得了重组猪源胰蛋白酶原,且酶活力较好,为进一步研究生产提供了基础。